Em nosso estudo, detectamos retrospectivamente a presença de mutações CALR em uma coorte de 524 pacientes JAK2 V617F-negativos que apresentaram suspeita clínica e/ou laboratorial de NMP com o objetivo principal de determinar o valor diagnóstico dessa detecção. Durante o período observado, mutações CALR não haviam sido investigadas rotineiramente em pacientes suspeitos de NMP em nosso centro, pois só recentemente foram descobertas1,2. Em contrapartida, a mutação JAK2 V617F já foi analisada rotineiramente desde a sua descoberta em 200520. Portanto, pacientes JAK2 V617F-positivos foram excluídos do estudo. Uma mutação MPL é um achado relativamente raro em pacientes com NMP e está presente em sua maioria em pacientes com ET ou PMF21. Em nosso laboratório, o teste de MPL foi incluído no algoritmo de diagnóstico em pacientes com suspeita de NMP apenas recentemente e só é realizado após a exclusão das mutações JAK2 V617F e CALR. Portanto, o estado de MPL não foi definido em todos os nossos pacientes no momento do primeiro exame.
O nosso centro é um hospital médico universitário que serve uma área com aproximadamente 1.000.000 habitantes e é um centro de referência para doenças hematológicas malignas. Todos os pacientes encaminhados para o departamento de hematologia foram primeiramente avaliados por clínicos gerais sem um conhecimento detalhado no campo das neoplasias hematológicas malignas. Como apresentado na Tabela 3, apenas uma proporção dos pacientes encaminhados para o Departamento de Hematologia tinha parâmetros clínicos e/ou laboratoriais patológicos suspeitos de NMP no momento do primeiro exame. Portanto, a maioria dos pacientes que foram encaminhados ao Departamento de Hematologia eram indivíduos sem malignidade hematológica, pois determinamos que 380 pacientes (380/524 = 72,5%) estavam livres de NMP. Esses pacientes foram diagnosticados com alterações secundárias no conteúdo sanguíneo periférico causadas por diferentes condições, como deficiência de ferro, doenças infecciosas e inflamatórias, hiposplenismo, malignidade, tabagismo, cirurgia recente, uso de corticosteroides e hipoxia crônica. Assim, o número de pacientes CALR-positivos em nossa coorte foi baixo. Identificamos 4,4% dos pacientes suspeitos de NMP como CALR positivos, a maioria dos quais foi diagnosticada com ET ou PMF. A maioria dos estudos similares analisou o número de pacientes CALR-positivos com NMP confirmado; portanto, o número de pacientes CALR-positivos foi muito maior, variando de 12 a mais de 20%22,23,24,25,26. Com base em nossos dados, seria benéfico melhorar a abordagem diagnóstica de pacientes com níveis aumentados de uma ou mais linhagens de células sangüíneas, pois, na maioria dos casos, isso não é causado por malignidade hematológica. Os pacientes devem ser rotineiramente rastreados para as causas mais comuns de eritrocitose secundária, trombocitose e leucocitose, e o hemograma deve ser repetido pelo menos uma vez nas visitas de acompanhamento antes de encaminhamento ao Departamento de Hematologia. Os testes genéticos moleculares devem ser reservados para pacientes com alta suspeita de doença hematológica clonal e não realizados em todos os pacientes encaminhados ao Departamento de Hematologia.
CALR mutações são comumente identificadas em pacientes JAK2 V617F-negativos com ET1,2. Em nosso centro, apenas uma minoria de pacientes CALR-positivos (7/23 = 30%) foi diagnosticada com ET de acordo com os critérios da OMS de 2008, no momento do primeiro exame. A principal razão para isso foi a reserva relativa ao exame da medula óssea em pacientes com trombocitose moderada e baixo risco de complicações trombóticas. No entanto, isto significa que poderíamos ter subestimado o número de pacientes com trombocitose clonal. Ao confirmar a presença de mutações CALR, pudemos diagnosticar retrospectivamente 9 pacientes com ET de acordo com os critérios modificados da OMS para ET13. Embora todos esses pacientes tenham tido acompanhamento em nosso departamento devido à alta suspeita de trombocitose clonal, é de grande benefício prognóstico e terapêutico poder confirmar o diagnóstico de ET por um procedimento não invasivo, como teste molecular-genético. As mutações CALR são, portanto, importantes marcas diagnósticas para a ET, como também foi confirmado recentemente na literatura27,28,
Todos os pacientes com DPM foram diagnosticados de acordo com os critérios da OMS no momento do exame no Departamento de Hematologia. A identificação da mutação CALR confirmou o diagnóstico retrospectivamente, mas não teve nenhum diagnóstico direto ou impacto terapêutico.
CMML é um subtipo de MDSs/MPNs e não estritamente MPNs12. As mutações CALR em pacientes com CMML são extremamente raras e não desempenham um papel importante em sua patogênese. Um estudo de grupo de Zamora et al. mostrou que apenas 1 em 174 pacientes com CMML apresentou uma mutação CALR29. O paciente em nosso estudo que foi diagnosticado com CMML tipo um e mais tarde evoluiu para mielofibrose pode ter sido mal diagnosticado no momento do primeiro exame, já que PMF e CMML compartilham muitas características comuns, incluindo monocitose e fibrose da medula óssea. Em um estudo recente de Hu et al., uma análise mais precisa permitiu que muitos pacientes diagnosticados com CMML fossem reclassificados como tendo PMF, mostrando que uma análise mais profunda deve ser realizada para fazer um diagnóstico preciso, especialmente em pacientes com biomarcadores moleculares típicos para ET/PMF11,30.
Mais de 50 mutações CALR de frameshift foram descritas, e todos estão localizados no exon 9 do gene CALR. Existem dois tipos principais de mutações CALR: tipo 1 (uma eliminação de 52-bp; p.L367fs*46) e tipo 2 (uma inserção TTGTC de 5-bp; p.K385fs*47). Com base em suas características moleculares, outras mutações podem ser agrupadas como tipo 1- e tipo 2- como31. Em nosso estudo, o tipo mais comum de mutação CALR foi o tipo 1, o que é consistente com os dados da literatura2,16,32. Mutações que não são do tipo 1 nem do tipo 2 devem ser subclassificadas como tipo 1- ou tipo 2-, pois podem ter impacto no fenótipo clínico e, no caso do DPP, até mesmo na sobrevida17. As mutações do tipo 1 e tipo 2 em nosso estudo foram definidas usando AGADIR15, um algoritmo estatístico de aproximação que calcula a propensão à hélice para as 31 sequências únicas de aminoácidos que são alteradas por mutações CALR16. Este algoritmo tem sido utilizado em estudos similares e representa uma ferramenta importante na subclassificação das mutações CALR16,17. Parece extremamente importante definir adequadamente o tipo de mutação CALR, pois esta também tem um impacto diagnóstico. Sabe-se que apenas as mutações que levam a uma mudança de quadro + 1 (-1 + 2) do quadro de leitura são patogênicas6. Outras mutações CALR podem ser variantes da CALR na linha germinal com um significado clínico desconhecido. Em nosso estudo, mutações CALR sem frameshift foram detectadas em dois pacientes. Um desses pacientes foi diagnosticado com trombocitose reativa no momento do exame no Departamento de Hematologia e foi definido retrospectivamente como CALR-positivo. Uma análise detalhada confirmou uma mutação CALR falsa que resulta na substituição de ácido glutâmico por ácido aspártico na posição de aminoácidos 398. A mesma mutação foi descoberta em um paciente com leucemia neutrofílica crônica definida pela OMS (CNL) em um estudo de Lasho et al. Seu estudo concluiu que as mutações CALR que não resultam em uma geração de um termo C distinto são sugestivas de um mecanismo patogênico diferente que ainda pode ser desconhecido33. Em nosso estudo, assumimos que nosso paciente não desenvolveu uma mutação CALR que implicaria em uma doença hematológica clonal. De acordo com a história do paciente, exame clínico e achados laboratoriais, a maioria sugere trombocitose reativa. No momento de escrever este artigo, o paciente estava em boa saúde sem possíveis complicações associadas à doença hematológica clonal.
Um outro paciente com uma mutação CALR não enquadrada foi diagnosticado com MPN-U. Este paciente carregava uma deleção na linha germinal no gene CALR (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), que já havia sido reconhecida em um paciente sintomático com MPN34. Embora o motivo KDEL tenha sido preservado, a deleção de um aminoácido (p.(Glu381del)) levou à alteração da estrutura secundária da proteína, bem como da estrutura tridimensional, o que levou à conclusão da natureza patogênica dessa deleção na estrutura23,34,35. Infelizmente, nosso paciente com MPN-U foi perdido para acompanhamento e não foi possível definir um diagnóstico hematológico exato ou possíveis complicações. Entretanto, os achados laboratoriais sugeriram uma doença hematológica clonal.
Em nosso estudo, descobrimos quatro novas mutações CALR no exon 9 que, ao nosso conhecimento, ainda não foram registradas na base de dados COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) ou HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk). A base de dados COSMIC é a maior base de dados de mutações somáticas em câncer humano do mundo. Ela descreve mais de 4 milhões de mutações de codificação36. A base de dados da HGMD representa uma tentativa de coletar todas as lesões genéticas conhecidas (publicadas) responsáveis por doenças hereditárias humanas19. As novas mutações que foram definidas em nosso estudo são NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), e NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Todas essas mutações foram do tipo 2.
ET e PMF estão associadas a um risco aumentado de eventos trombóticos e tromboembólicos, que representam importantes causas de morbidade e mortalidade37. A redução do risco de complicações trombóticas e tromboembólicas é um dos objetivos mais importantes do tratamento, especialmente em pacientes com ET38. Esses pacientes também apresentam maior risco de complicações hemorrágicas, que podem estar relacionadas a complicações do tratamento ou à síndrome de von Willebrand adquirida (AVWS) devido à trombocitose extrema (plaquetas > 1000 × 109/L)28,39,40. O risco de trombose em pacientes com ET excede 20%41. Em um estudo sueco, 35% dos pacientes com ET desenvolveram complicações vasculares42. No PMF, os eventos trombóticos são tão comuns quanto no ET43. A prevalência de complicações trombóticas em pacientes com DPP varia de 7 a 30%44,45,46. Em nosso estudo, a prevalência de complicações trombóticas em pacientes CALR-positivos foi de 30%. Entretanto, três pacientes haviam desenvolvido uma complicação trombótica há mais de 10 anos antes da suspeita do diagnóstico de NMP. A prevalência real de complicações trombóticas em nosso estudo foi, portanto, menor. Um paciente desenvolveu hemorragia vítrea que foi resultado de uma terapia anticoagulante inadequada com varfarina. Nenhum dos dois pacientes com complicação hemorrágica tinha trombocitose extrema no momento da complicação. Em comparação com as mutações JAK2 V617F e MPL, a CALR é uma mutação favorável e está associada a uma menor incidência de eventos trombóticos1,2,47. A maioria dos pacientes CALR positivos que desenvolveram complicações trombohemorrágicas foi diagnosticada com mutações do tipo 1 (71,4%). Como já demonstrado, pacientes com mutações do tipo 1 apresentaram maior risco de trombose em comparação aos pacientes com mutações do tipo 210,
CALR são conhecidos atualmente como um dos três principais tipos de mutação, além de JAK2 V617F e a mutação MPL, em pacientes com ET ou PMF. Entretanto, ainda havia 10-15% dos pacientes com ET ou PMF com um marcador genético molecular desconhecido subjacente à doença. Estes pacientes são denominados “triplamente negativos “48. Nesses pacientes, novos biomarcadores moleculares foram pesquisados através da sequenciação de exons codificadores em genes de câncer mielóide, o que tem mostrado resultados promissores. Isso pode fornecer uma abordagem personalizada para o diagnóstico em pacientes com NMP49,
CALR mutações em pacientes com NMP também estão sob investigação por seu potencial terapêutico50,51,52. As mutações CALR exon 9 podem ser alvos para a imunoterapia do câncer, já que demonstraram atuar como imunogênicos neo-antigênicos51. No tratamento da NMP, poderia ser benéfico combinar vacinas CALR com tratamentos imunomoduladores53, como interferon-alfa (IFN-α)54 ou morte programada 1 ligante (PD-L1)55, como uma vacinação combinatória contra o câncer53. As mutações CALR, além de serem importantes marcadores diagnósticos e prognósticos em pacientes com NMP, podem se tornar um alvo terapêutico importante em um subgrupo de pacientes com NMP no futuro.