Esta situação satisfaz praticamente todos os casos desde a sala de aula até o laboratório de pesquisa, até considerarmos os canais de cloreto. Sabemos que eles existem, são importantes e podem fazer bons alvos de medicamentos em várias áreas da doença, mas até recentemente, eles permaneceram um pouco estigmatizados e antiquados no mundo da terapêutica. A falta de ligandos seletivos não tem ajudado em nada. A única exceção a isto tem sido o receptor GABA-A que é acoplado a um canal de cloreto intrínseco que se abre ao ligar o neurotransmissor inibitório GABA. As benzodiazepinas têm potenciado este receptor desde que o Valium se tornou disponível nos anos 60, fornecendo efeitos sedativos e anticonvulsivos. Isto introduz um conceito importante: existem várias famílias de genes e diferentes tipos de proteínas que podem ser descritas como sendo canais de cloreto.
Isto contrasta com o que entendemos de canais de íons catiônicos seletivos onde há pouca flexibilidade na estrutura da proteína que pode formar um poro que é seletivo para potássio, sódio ou cálcio; a diversidade destes canais de íons é trazida pelas variações nos domínios proteicos distintos do poro que influenciam o comportamento de abertura-fechamento. Para ser justo, não parece haver muitas razões fisiológicas para que um canal aniônico exiba seletividade de cloro, pois há pouco papel fisiológico no transporte de membrana de outros halogênios ou pequenos ânions; qualquer canal aniônico será, por padrão, um canal de cloro do ponto de vista fisiológico. Por outro lado, as correntes de potássio, sódio e cálcio da membrana desempenham papéis fundamentais diferentes e a permeabilidade seletiva da membrana a esses cátions é crucial para a função celular e para a própria vida.
GABA-A receptores são membros das famílias de canais de íons ligado-ligados cys-loop pentamericanos, que incluem vários tipos de canais de neurotransmissores excitatórios e inibitórios. A proteína transmembrana reguladora da fibrose cística (CFTR) é um canal de cloreto regulado por nucleotídeos. É um membro da diversificada família de cassetes de ligação ATP (ABC) e é o único que parece não transportar qualquer substrato através de uma membrana, mas sim funcionar como um canal de cloreto. A família CLC de canais de cloreto em tensão é originária de outra família genética distinta e tem uma estrutura geral única entre as proteínas da membrana. Esta família de proteínas trouxe muitas surpresas nos últimos 30 anos e os membros desta família serão introduzidos aqui e também como eles podem ser considerados alvos de drogas.
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Surgiram outros desenvolvimentos interessantes do campo de canais de cloreto após a identificação molecular das proteínas subjacentes aos canais de cloreto ativado por cálcio (ClCa). Funcionalmente, conhecemos seus papéis fisiológicos há algum tempo, mas a recente identificação molecular das proteínas do canal permitiu o desenvolvimento de ferramentas moleculares e farmacológicas para sondar e alterar sua atividade. Esta revisão foca o potencial farmacológico de visar os canais de ClCa e proteínas CLC; sua função e localização subcelular estão resumidas na Figura 1.
Figure 1
Uma introdução às proteínas CLC
Os nove membros desta família de proteínas são CLC-1 a 7, CLC-KA e KB. O membro fundador, CLC-1, é o canal de cloreto de tensão do músculo esquelético e será discutido abaixo. Muitos estudos funcionais foram realizados em um homólogo com o título honorário de CLC-0, isolado do órgão elétrico Electroplax, o que permite que o raio atordoe suas vítimas aquáticas. A reconstituição da CVX-0 em bilayers lipídicos e o registro eletrofisiológico das correntes que fluem através de canais de íons únicos revelaram uma propriedade intrigante. Normalmente, ao registrar a corrente de uma pequena mancha de membrana contendo um único canal iônico, observa-se flutuações entre duas amplitudes de corrente: uma representando o canal fechado e a outra representando a corrente que flui através do canal aberto. As flutuações refletem as transições entre os estados cinético aberto e fechado. Com CLC-0, no entanto, ficou evidente que a proteína de canal de íon único consistia em dois poros equivalentes que podiam abrir independentemente1. Este canal foi, portanto, descrito como sendo de barril duplo (Figura 2). Assim, não foi grande surpresa que as estruturas cristalinas dos homólogos das bactérias entéricas revelassem que o complexo proteico era um dímero, com cada subunidade possuindo uma via condutora de íons2 (Figura 2).
Figure 2
A segunda surpresa surgiu quando experimentos funcionais detalhados foram realizados em CLC-ec1 de E. coli. Ao invés de funcionar como um canal de cloreto, como seu parente há muito perdido no músculo esquelético vertebrado, CLC-ec1 é um transportador de troca 2Cl-/H+, ou antiporter, com estrita estequiometria de troca 2:13. Esta proteína é importante para a sobrevivência de bactérias entéricas com baixo pH4 e é provável que explore um gradiente de cloreto para manter o pH celular a um nível tolerável. As CLCs procarióticas podem, portanto, ser alvos de inibidores para tratar E. coli ou infecção por Salmonella4 patogênica. A descoberta do comportamento de troca iônica naturalmente estimulou esforços adicionais para determinar se alguma dessas trocas clorido-por-protões existia em CLCs mamíferos, na suposição de que a troca Cl-/H+ pode ser a verdadeira função das CLCs arquetípicas e aquelas identificadas como canais de cloreto podem ser apenas exceções à regra. Este parece ser o caso, pois há fortes evidências de que CLC-3 até CLC-7 funcionam como transportadores de trocas 2Cl-/H+, residindo principalmente em organelas intracelulares, enquanto CLC-1, CLC-2, KA e KB são verdadeiros canais de íons condutores de cloreto de membrana de plasma5-9. Como a propriedade arquetípica CLC é o transporte de trocas, sendo encontrada em todas as formas de vida celular, esta última subclasse de proteínas, os canais de cloreto bona fide, podem, portanto, ser considerados transportadores de cloreto “quebrados”, que perderam o acoplamento do transporte de cloreto ao movimento de um segundo íon do substrato.
CLC-1
Este fundador da família CLC é o canal de cloreto em tensão do músculo esquelético e serve para regular o potencial da membrana e repolarizar a membrana seguindo os potenciais de ação para relaxar o músculo. Na maioria dos tecidos, espera-se que os canais de potássio desempenhem esse papel, o que eles fazem no músculo cardíaco e liso, assim como a regulação da excitabilidade da membrana em outros tipos de células. O sistema tubular transversal é uma extensão da membrana plasmática (sarcolemma) e penetra no tecido contrátil. É crítico para a rápida propagação da atividade elétrica por todo o músculo e orquestra contração rápida e controlada. O efluxo de potássio das células musculares para o espaço confinado do t-tubo elevaria a concentração extracelular de potássio e colapsaria este gradiente iônico, o que levaria a uma despolarização prolongada da membrana. Com os canais de cloreto a desempenhar o papel predominante de repolarização, isto é evitado. A perda de mutações funcionais na CLC-1 leva a miotonia no homem, cabras e ratos (para uma revisão recente ver10) e caracteriza-se por um relaxamento muscular prejudicado, consistente com a perda de uma corrente de membrana repolarizante.
Com expressão confinada ao músculo esquelético, a CLC-1 pode ser um alvo atractivo para medicamentos que controlam a contracção muscular aumentando ou diminuindo a função da CLC-1 e assim reduzindo ou aumentando a excitabilidade muscular, respectivamente. Compostos que aumentam a função da CLC-1 podem ser capazes de tratar a miotonia, particularmente nos casos em que poderiam compensar a perda parcial da atividade do canal de cloreto. A inibição da CLC-1 pode reduzir o limiar de contração muscular e pode ser útil em casos de fraqueza muscular ou doenças degenerativas como distrofia muscular.
CLC-2
O canal de cloreto de rectificação interna, CLC-2, tem uma distribuição um pouco disseminada dos tecidos. Ela pode ser encontrada nos neurônios centrais onde regula a atividade neuronal11-13. Em astrocitos, seu alvo subcelular nas junções celulares é regulado por uma interação com o GlialCAM (MLC1), mutações nas quais interrompem esse alvo e causam leucoencefalopatia megalencefálica14. Os interesses terapêuticos recentes envolvem a expressão da CLC-2 na mucosa intestinal e nos bronquíolos pulmonares, onde desempenha um papel nas secreções intestinais e pulmonares, respectivamente. A Lubiprostona, uma droga usada clinicamente para aliviar a constipação, foi proposta para exercer seu efeito ativando a CVX-2, mas este efeito é controverso. Enquanto este composto ativa os canais da CVX-2 em alguns estudos, em outros ele regula o tráfico da CVX-2 e aumenta a função da CFTR através da ativação do receptor da prostaglandina15,16. Entretanto, há evidências suficientes de que o aumento da função da CLC-2 nas vias aéreas poderia fornecer uma via alternativa de cloro na fibrose cística17,
CLC-KA/KB
Estes canais de cloro são notavelmente expressos em epitélios renais e contribuem para a permeabilidade das membranas celulares ao fluxo passivo de cloro. Eles têm um papel fundamental no membro ascendente e nos túbulos distais do nefrónio, proporcionando uma via basolateral para a reabsorção do cloro, após o transporte da urina primária através da membrana apical. O gene CLCKB, que codifica CLC-KB, é um dos cinco genes que estão na base da síndrome de Bartter. Mutações com perda de função na CLC-KB resultam em reabsorção defeituosa do cloro e, portanto, levam a um distúrbio de desperdício de sal, que está associado à poliúria. Uma das principais características dos indivíduos que são afetados pelas mutações CLC-KB (Bartter tipo III) é a baixa pressão sanguínea. Uma forma mais grave da doença é causada por mutações no gene BSND (Bartter tipo IV), que codifica Barttin, uma proteína acessória importante para o tráfico tanto de CLC-KA como de KB para a membrana plasmática18. Esta forma de desordem também inclui a surdez sensorial, que se pensa ser causada pela perda do tráfico tanto de CLC-KA como de KB para as membranas epiteliais no ouvido interno. Presumivelmente, a perda da atividade de CLC-KA ou KB, mas não de ambas, pode ser tolerada pelo sistema auditivo. Isso sugere que inibidores seletivos para CLC-KA ou CLC-KB, ou inibição parcial de ambos, podem atuar como um novo diurético de loop com potencial para baixar a pressão arterial e com poucos efeitos colaterais. Isso levou ao estudo de sua farmacologia e ao desenvolvimento de novos derivados inibidores com baixa afinidade micromolar19, que tiveram efeitos diuréticos quando administrados a ratos20. Por outro lado, medicamentos que ativam os canais CLC-KB podem aumentar a atividade residual de canais defeituosos em pacientes Bartter tipo III.
CLC-7
Da subclasse 2Cl-/H+ do transportador de troca, a CLC-7 é um alvo promissor para a ação do medicamento e sua inibição pode ser benéfica na osteoporose. Mais uma vez, esta indicação tem sua origem em observações de doenças humanas causadas por mutações de perda de função na CLC-7, que causam asteropetrose21. Nesta desordem, a remodelação óssea por osteoclastos é deficiente, o que se pensa ser causado por ácido defeituoso e secreção enzimática. Isso leva a um osso denso, que se reproduzido por um inibidor da CVX-7 poderia reduzir a dissolução do osso e, portanto, fortalecer o esqueleto dos pacientes com osteoporose22,23. Em estudos de prova de conceito, a inibição farmacológica da acidificação24 ou a interrupção da função da CLC-7 por anticorpos25 reduziu a reabsorção óssea. Entretanto, a inibição da CLC-7 pode não estar isenta de complicações, pois estudos com humanos e camundongos sugerem que a falta da função CLC-7 também pode estar associada ao armazenamento neuronal e a distúrbios de degeneração devido à redução da função lisossômica26.
Mutações humanas com perda de função – lições de CFTR
Vale uma breve pausa neste ponto para considerar que algumas das indicações terapêuticas para novos medicamentos visados pela CVX visam tratar distúrbios distintos e no extremo oposto daqueles que são causados por função CVX defeituosa. Além das descritas acima, a doença de Dent I é uma doença renal ligada ao X que é causada pela perda da função CLC-5 (ver27 para uma revisão recente). Todas são doenças hereditárias raras e um defeito proteico importante envolve a redução da actividade proteica ou o tráfico para a membrana alvo. Na verdade, muitas mutações individuais causam retenção de ER e uma falta de maturação proteica. Um paralelo poderia ser feito com fibrose cística, com a maioria dos indivíduos afetados possuindo a mutação retida por ER ΔF508. Abordagens recentes e estratificadas para o tratamento da fibrose cística têm sido o resultado de um ataque duplo para corrigir a dobra da proteína mutante (correctores de FC) e/ou aumentar a actividade dos canais de cloreto de membrana plasmática CFTR (potenciadores de FC). O sucesso está surgindo com a classe de potenciadores28, que são eficazes em pacientes com mutações que reduzem a atividade do CFTR sem perda de biossíntese de proteína ou tráfico (por exemplo, G551D), porém a eficácia dos corretores de dobra (que é necessária na maioria dos casos) ainda está por ser estabelecida29. Embora as doenças associadas à perda da função da CVX sejam todas doenças genéticas raras, podemos um dia ser capazes de tratar indivíduos com miotonia, síndrome de Bartter, doença de Dent e osteopetrose, bem como fibrose cística com medicamentos que corrigem a causa real da sua doença.
Calcium-activated chloride channels
Finalmente, será feita menção aos canais de cloreto de cálcio ativado (ClCa), que têm papéis fisiológicos claramente definidos em vários tipos de células, porém sua identificação molecular sofreu alguns falsos e gaguejados inícios. A história envolve quatro tipos de proteínas: membros das famílias de genes CLCA, Bestrophin, Tweety e TMEM16. Em todos os casos, sua sobreexpressão recombinante resultou na geração de correntes de cloreto de membrana que são estimuladas pelo aumento da concentração intracelular de cálcio e, em diferentes extensões, pela despolarização da membrana. A jornada da CLCA chegou ao fim quando se descobriu que se tratava de uma proteína que era secretada, mas também, provavelmente, não pregulou a expressão membranar dos canais de ClCa endógenos ao sistema de expressão30. As proteínas Tweety e Bestrophin não exibem todas as propriedades dos canais de ClCa estudados nos principais tecidos, embora Best1 pareça responsável por um componente do ClCa em neurônios sensoriais31 e também possa ser um importante regulador da liberação de cálcio a partir do retículo endoplasmático32,33. Três estudos independentes propuseram o TMEM16A (também chamado Ano1) como candidato para um componente importante, se não na sua totalidade, para um canal de cloreto ativado pelo cálcio34-36. Muitos estudos posteriores, facilitados pela geração de ferramentas moleculares, apoiaram isto. O TMEM16A é importante para regular a excitabilidade da membrana no músculo liso vascular, é upregulado em um modelo animal de hipertensão pulmonar e o tônus pode ser reduzido pela inibição do canal37,38. Em neurônios sensoriais, o TMEM16A associa a presença de mediadores inflamatórios à hiperexcitabilidade da membrana e a inibição do TMEM16A tem efeitos antinociceptivos39. Em modelos animais de asma, a expressão desse canal clorídrico particular é aumentada e sua inibição pode ter efeitos benéficos40. Também é encontrada nas células intersticiais do Cajal do intestino e a função do canal é necessária para a contração rítmica do músculo liso na parede intestinal41. Além disso, a ativação do TMEM16A pode fornecer uma via alternativa para a secreção epitelial de cloreto na fibrose cística42. Embora ainda haja algum debate em torno da função precisa do restante da família TMEM16, a função ClCa também foi atribuída ao TMEM16B (Ano2), que se pensa estar subjacente ao canal ClCa em células capilares olfatórias43,44. Também pode haver papéis para esta classe de canal iônico na biologia celular cancerígena e sua inibição pode prevenir a proliferação celular45-48,
Comentários finais
Esta revisão destacou os diversos papéis das proteínas condutoras ou transportadoras de cloreto e como sua disfunção está associada a distúrbios humanos ou sintomas semelhantes a doenças em modelos animais. Há uma grave falta de reagentes farmacológicos que inibem, ativam ou melhoram o tráfico de canais e transportadores de cloro por membranas. Estão sendo feitos progressos com medicamentos que revertem a função defeituosa do CFTR na fibrose cística, o que espera-se que resulte em medicamentos específicos para os diferentes tipos de mutação hereditária. Os inibidores e ativadores dos canais de cloreto ativado por cálcio TMEM16A42,49 estão provando ser ferramentas de laboratório úteis e novos compostos podem fazer medicamentos eficazes, especialmente se puderem proporcionar efeitos específicos aos tecidos. As moléculas específicas para CLCs específicos são provavelmente as mais evasivas. A compreensão da base estrutural da ativação de CLCs em tensão50 pode identificar domínios protéicos que são passíveis de carga através de um projeto racional de medicamentos baseado em estrutura. Tais ferramentas nos permitirão colocar à prova algumas das novas idéias terapêuticas que foram revisadas e apresentadas aqui.
Biografia do Autor
Dr Jon Lippiat completou seu doutorado sobre a estrutura, função e farmacologia dos canais de potássio na Universidade de Leicester. Ele estudou a função das células beta pancreáticas e diabetes na Universidade de Oxford antes da sua nomeação como Professor de Farmacologia na Universidade de Leeds. Sua pesquisa envolve elucidar as propriedades estruturais e fisiológicas de diversos tipos de canais e transportadores de íons e seus potenciais alvos através de novos reagentes farmacológicos.