Uma Quimera era uma criatura na mitologia grega geralmente representada como um composto de um leão, cabra e serpente. O uso contemporâneo do termo “quimera” no transplante de células hematopoiéticas deriva desta ideia de entidade “mista”, referindo-se a alguém que tenha recebido um transplante de tecido geneticamente diferente. Um teste de quimero após um transplante de células estaminais hematopoiéticas envolve a identificação do perfil genético do receptor e do do doador e a avaliação da extensão da mistura no sangue, medula óssea ou outro tecido do receptor.
Teste de quimero (análise de enxerto) pelo DNA emprega metodologia comumente usada em testes de identidade humana e é realizado pela análise de polimorfismos genômicos chamados short tandem repeat (STR) loci. Estes loci consistem numa sequência central de ADN que é repetida um número variável de vezes dentro de um locus genético discreto. O termo STR, também referido como micro satélites, refere-se ao número de pares de bases de uma sequência de ADN de núcleo repetido em tandem que varia entre 2-8 pares de bases de comprimento. Estes loci exibem alelos que podem diferir em comprimento entre indivíduos e são herdados como traços mendelianos codominantes. Os loci STR foram identificados em todo o genoma humano e alguns loci têm mais de 25 alelos.
A informação da sequência de ADN dentro das regiões de flanco conservadas dos loci é usada para criar pares de primer oligonucleótidos para os STRs. Estes primers são usados na amplificação das amostras de teste em PCR (reacção em cadeia da polimerase). Esta técnica pode amplificar a seqüência STR até um bilhão de vezes, fornecendo material que pode ser separado com um gel eletroforético ou por eletroforese capilar (CE). A genotipagem é feita através da avaliação do tamanho do fragmento de DNA. A referência a uma escada alélica pode ser usada para identificação exacta dos alelos STR.
O sistema STR/CE baseado em PCR tem várias vantagens sobre outros métodos de análise. A amplificação de múltiplos loci STR pode ser combinada (multiplexada) num único tubo, permitindo a análise de até dezasseis loci numa única reacção. Uma vez que são necessárias quantidades mínimas de ADN, podem ser utilizadas amostras com baixos números de células, e o tamanho reduzido dos alelos STR permite até mesmo a utilização de amostras de ADN degradadas. Os dados digitais facilitam a análise e o arquivamento, e o processo CE é rápido e rentável. A amplificação PCR e análise de loci STR fornece um método rápido e fiável para a avaliação do estado de gravação no cenário de transplante de células estaminais.
A tecnologia actualmente utilizada permite a co-amplificação e detecção a três cores de dezasseis loci que são subdivididos em 3 conjuntos de 5 ou 6 loci que exibem fragmentos amplificados com intervalos de tamanho não sobrepostos.
Durante o passo de amplificação PCR, os fragmentos amplificados são rotulados com corantes fluorescentes. Após a amplificação da PCR, as amostras são processadas num sistema de electroforese capilar (CE).
Análise de dados é facilitada por um software de análise de fragmentos que dimensiona os fragmentos de ADN usando uma pista interna padrão com a amostra e atribui genótipos por comparação com uma escada de alelos STR incluída na corrida CE. Isto fornece perfis genotípicos distintos de STR para o doador e para o receptor do transplante. Os loci STR que são polimórficos (ou seja, informativos) entre esses indivíduos são usados para avaliar quantidades relativas de DNA do receptor e do doador na amostra pós-transplante.
As amostras testadas podem ser de qualquer material contendo DNA, incluindo medula óssea, sangue periférico, tumores sólidos, tecido epidérmico, folículos pilosos, esfregaços bucais e subconjuntos de células fracionadas. Uma vez que a amplificação PCR de uma amostra é rotineiramente realizada com menos de 2 ng de DNA genómico (equivalente a aproximadamente 300 células), os testes de quimerismo por este método podem ser realizados com sucesso mesmo em pacientes com falha do enxerto, leucopenia grave, ou de fracções de subconjuntos de células hematopoiéticas. A análise STR tem sido usada para avaliar o estado de enxerto de pacientes que receberam um transplante de células hematopoiéticas, incluindo pacientes que receberam unidades doadoras de sangue do cordão umbilical duplo ou um segundo transplante de um doador diferente; bem como para confirmar a identidade genética de gêmeos putativos idênticos, e para detectar o enxerto de células maternas derivadas inutero entre pacientes com diagnóstico de Imunodeficiência Combinada Grave (SCID). A análise STR/CE é um procedimento rápido, fiável, preciso e reprodutível.
Limitações do Ensaio
- O ADN suficiente deve ser isolado das amostras de teste para permitir uma amplificação PCR robusta. Os métodos de isolamento de ADN devem estar disponíveis para lidar com amostras com baixa contagem de células, tais como podem ser encontrados em recipientes com falha do enxerto e de subconjuntos de linhagem de glóbulos brancos seleccionados específicos da Citometria de Fluxo. As amostras podem ter concentrações demasiado baixas para quantificar por Espectrofotometria UV OD260. Amostras de ADN de 5.000 a 30.000 células isoladas fornecem uma amplificação aceitável. O laboratório tem directrizes que definem quando a análise da amostra deve ser repetida.
- Com os kits comerciais, muitos STR loci têm alelos informativos tanto para o doador como para o receptor no cenário do doador não relacionado. No entanto, o número de loci STR informativos pode ser limitado a apenas 3 entre os pares de transplantes de doadores relacionados. Valores quantitativos representando a média de apenas 3 loci STR foram encontrados como reprodutíveis.
- Patientes com doenças malignas podem ter mutações clonais que impactam certos loci STR. Um alelo do paciente pode estar ausente em um ou mais loci STR ao comparar os alelos identificados na amostra pré-transplante do paciente versus a amostra pós-transplante. Em raras circunstâncias, um alelo STR extra do paciente pode ser detectado em um locus específico que não estava presente na amostra pré-transplante. Na maioria dos casos, estas anomalias são provavelmente devidas a translocações cromossômicas. Os alelos em falta podem também ser o resultado de uma mutação dentro das sequências de flanco conservadas da STR onde se encontram os iniciadores da PCR. Os dados dos loci STR com alelos em falta ou extra não são usados para quantificação.
- Se não estiverem disponíveis células pré-transplante do paciente, amostras como esfregaços bucais, biopsia cutânea ou raízes de cabelo podem ser recolhidas após o transplante. Entretanto, deve-se observar que as amostras vestibulares podem conter quantidades significativas de células doadoras.
- O ensaio não se destina à detecção de doença residual mínima.
Indicações Clínicas para Testes de Quimero em Transplante de Células Hematopoiéticas
Documentação pós-transplante de rotina da origem do doador/receptor de glóbulos brancos no sangue periférico e/ou medula. A documentação do enxerto pode incluir testes de subconjuntos de células específicas da linhagem, como células T positivas CD3 e células mielóides positivas CD33.
Avalie células doadoras/receptoras em pacientes com função inadequada da medula óssea.
Definir se células recidivantes ou malignas novas tiveram origem em células receptoras ou doadoras.
Avaliar os riscos prognósticos de rejeição e malignidade recorrente.
Documentar a persistência de células doadoras pós-transplante em pacientes com doença recorrente ou antes da infusão de linfócitos do doador (DLI).
Avalie se ocorreu rejeição de enxerto em receptores que são candidatos a um segundo transplante.
Diferencie a origem das células doadoras em receptores que receberam um segundo transplante com um doador diferente ou um transplante com unidades de sangue de cordão duplo.
Detectar a presença de células derivadas maternas em pacientes diagnosticados com Imunodeficiência Combinada Grave (SCID).
Verificar a identidade genética de gémeos putativos idênticos.
Perguntas Frequentes
Perguntas: Como são analisados os múltiplos doadores?
Resposta: É essencial identificar os loci STR que mostram pelo menos um alelo STR único para o paciente e cada doador.
Pergunta: Porque é que é testado o registo materno?
Resposta: Os doentes diagnosticados com uma Imunodeficiência Combinada Grave (SCID) podem ter sido enxertados com células hematopoiéticas de origem materna in-utero. Alguns subconjuntos de células específicas da linhagem (especialmente células CD3-positivas) podem ser predominante ou inteiramente de origem materna.
Question: Qual é a diferença entre quimero “cheio” e “misto”?
Resposta: Quimilarismo “completo” é usado para se referir a um paciente que exibe um fenótipo pós-transplante em células hematopoiéticas que é todo de origem doadora.
Quimilarismo “misto” refere-se a um paciente que exibe uma mistura de fenótipo de paciente e doador em células hematopoiéticas após o transplante.
Questão: E se uma amostra de base do receptor não estiver disponível?
Resposta: Várias opções estão disponíveis para a obtenção de uma amostra de receptor pós-transplante: esfregaço bucal, raiz de cabelo ou biópsia de pele podem ser usadas para uma amostra de base de receptor. As amostras de esfregaço bucal devem ser usadas com cautela, uma vez que as células doadoras podem estar presentes em quantidades significativas nas amostras bucais.
Question: E se uma amostra de base de dador não estiver disponível?
Resposta: Se o doador estiver vivo, obtenha uma nova amostra de sangue. Se o doador não estiver vivo, amostras pós-transplante devem ser comparadas com a linha de base do paciente pré-transplante para identificar alelos STR que são detectados mas não são de origem do paciente.
Question: Porque é que o HLA não é um meio viável de monitorizar a gravação?
Resposta: Os doadores de transplante são escolhidos para serem o mais próximo possível do receptor. Não existem marcadores HLA que diferenciem o receptor e o doador quando são combinados, e apenas um ou dois se não forem compatíveis. Além disso, outras tecnologias são frequentemente mais sensíveis para este fim do que a monitorização de alelos não combinados HLA; consequentemente, outros loci são usados para fornecer perfis únicos.
Question: O que é um locus informativo do STR?
Resposta: Este é um locus com pelo menos um alelo único para o receptor ou para o doador. Para ser útil para os cálculos do quimero, um locus deve ter alelos únicos para ambos. Pode haver um grande número de loci informativos quando um doador não relacionado é usado para o transplante, mas muito poucos se for usado um irmão compatível. Devido às diferenças na eficiência de amplificação dos alelos em cada locus, é preferível obter valores médios ou medianos de vários loci para aumentar a precisão. Os resultados de loci individuais são reproduzíveis de forma confiável, de modo que mesmo um locus pode ser usado para amostras sequenciais de tendências.
Question: Qual é o locus “amelogenin” que está incluído em alguns painéis de amplificação?
Answer: O gene amelogenin está localizado nos cromossomas X e Y. Não é um STR, mas exibe diferentes tamanhos de produtos nos respectivos cromossomas. Isto torna-o útil para determinar o sexo. É incluído no painel primário por vendedores de kits comerciais, visando a comunidade forense, onde a diferenciação X/Y é amplamente utilizada. Geralmente não é usado para análise quimérica uma vez que não pode fornecer um marcador feminino único (uma amostra masculina inclui sempre um alelo X); nem é útil na avaliação de amostras após um transplante de células estaminais sexuadas.
Question: Como a análise de quimiotipagem STR é diferente da genotipagem?
Resposta: “Genótipo” refere-se aos alelos particulares presentes num locus especificado. A genotipagem é feita para estabelecer os perfis dos receptores e dos doadores nos testes de quimiotipagem. Quando a análise quimérica é feita após um transplante de células estaminais, os perfis genotípicos do receptor e do do doador são comparados com o perfil da amostra pós transplante para avaliar quanto de cada componente está presente.
Genotipagem também é utilizada em outros cenários, tais como forense e teste de parentesco. Os analistas forenses utilizam genótipos para identificar a fonte de evidência em casos criminais e para excluir pessoas da consideração como suspeitas. Eles também podem identificar restos humanos em casos de “Desconhecidos” e em desastres em massa. As determinações parentais são feitas de forma semelhante para excluir alguém como possível pai, encontrando alelos presentes na criança que não correspondem nem à mãe nem ao pai putativo.
Literatura Citada/Recomendada Leitura
Bryant E, Martin PJ. Documentação de gravura e caracterização do quimero após transplante de células hematopoiéticas. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Transplante de células hematopoiéticas. 2ª ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.