A capacidade de demonstrar uma correlação entre um par de biomoléculas foi muito reforçada por Erik Manders da Universidade de Amesterdão que introduziu o coeficiente de correlação de Pearson aos microscopistas, juntamente com outros coeficientes dos quais os “coeficientes de sobreposição” M1 e M2 provaram ser os mais populares e úteis. O propósito do uso de coeficientes é caracterizar o grau de sobreposição entre imagens, geralmente dois canais em uma imagem de microscopia multidimensional registrada em diferentes comprimentos de onda de emissão. Uma abordagem popular foi introduzida por Sylvain Costes, que utilizou o coeficiente de correlação de Pearson como uma ferramenta para estabelecer os limiares exigidos por M1 e M2 de uma forma objetiva. A abordagem de Costes pressupõe que apenas correlações positivas são de interesse e não fornece uma medida útil de PCC.
Embora o uso de coeficientes possa melhorar significativamente a confiabilidade da detecção de colocalização, ela depende do número de fatores, incluindo as condições de como as amostras com fluorescência foram preparadas e como as imagens com colocalização foram adquiridas e processadas. Os estudos devem ser realizados com muita cautela, e após uma leitura cuidadosa dos antecedentes. Atualmente, o campo está sendo atrapalhado pela confusão e uma abordagem padronizada ainda está por ser firmemente estabelecida. As tentativas de corrigir isso incluem a reavaliação e revisão de alguns dos coeficientes, aplicação de um fator de correção de ruído, “Replicar correlações baseadas em ruído corrigidas para medidas precisas de colocalização”. e a proposta de outros protocolos, que foram cuidadosamente revisados por Bolte e Cordelieres (2006). Além disso, devido à tendência das imagens fluorescentes a conterem uma certa quantidade de sinal desfocado, e de poisson shot e outros ruídos, geralmente requerem pré-processamento antes da quantificação. A restauração cuidadosa da imagem por deconvolução remove o ruído e aumenta o contraste nas imagens, melhorando a qualidade dos resultados da análise de colocalização. Até agora, os métodos mais frequentemente utilizados para quantificar a colocalização calculam a correlação estatística das intensidades de pixels em dois canais microscópicos distintos. Estudos mais recentes mostraram que isso pode levar a altos coeficientes de correlação mesmo para alvos que são conhecidos por residirem em diferentes compartimentos celulares. Uma quantificação mais robusta da colocalização pode ser obtida combinando o reconhecimento de objetos digitais, o cálculo da sobreposição da área e a combinação com um valor de correlação de intensidade de pixel. Isto levou ao conceito de um coeficiente de correlação de Pearson corrigido por objeto.