US and Canadian vistors, request a FREE SAMPLE of our CTAB based SYNERGY™ 2.0 Plant DNA Extraction Kit HERE.
Isolating DNA from plant tissues can be very challenging as the biochemistry between divergent plant species can be extreme. Ao contrário dos tecidos animais, onde o mesmo tipo de tecido de diferentes espécies geralmente tem características semelhantes, as plantas podem ter níveis variáveis de metabólitos e biomoléculas estruturais. Polissacarídeos e polifenóis são duas classes de biomoléculas vegetais que variam muito entre espécies e são muito problemáticas ao isolar o DNA. Polissacarídeos e polifenóis contaminantes podem interferir com manipulações do DNA após o isolamento.
Métodos disponíveis que removem eficazmente os polissacarídeos e polifenóis das preparações de DNA de plantas. A utilização de CTAB (brometo de cetil trimetilamónio), um detergente catiónico, facilita a separação dos polissacáridos durante a purificação, enquanto os aditivos, como a polivinilpirrolidona, podem ajudar na remoção dos polifenóis. Os tampões de extração à base de CTAB são amplamente utilizados na purificação do DNA de tecidos vegetais.
Uma opção para purificar o DNA usando explorações de CTAB que os polissacarídeos e o DNA têm solubilidades diferentes no CTAB, dependendo da concentração de cloreto de sódio. Em concentrações mais altas de sal, os polissacarídeos são insolúveis, enquanto que em concentrações mais baixas o ADN é insolúvel. Consequentemente, ao ajustar a concentração de sal em lisados contendo CTAB, os polissacarídeos e o DNA podem ser precipitados diferencialmente.
Polyphenols são compostos que contêm mais de um anel fenólico (por exemplo, tanino), uma estrutura que se liga muito eficientemente ao DNA. Eles ocorrem naturalmente nas plantas, mas também são gerados quando as plantas têm danos nos tecidos (acastanhamento). Após a homogeneização dos tecidos das plantas, os polifenóis são sintetizados por polifenóis oxidase libertados. A adição de pirrolidona de polivinil previne a interação do DNA e anéis fenólicos pela ligação dos polifenóis.
CTAB protocolos baseados tendem a funcionar muito bem, mas uma desvantagem significativa é que extrações de clorofórmio são rotineiramente usadas para separar moléculas solúveis orgânicas do DNA. Como o clorofórmio é cancerígeno, muitas instituições desaprovam a sua utilização. Assim, um método alternativo que evita o clorofórmio foi desenvolvido pela OPS Diagnostics; ele pode ser encontrado na página Synergy™ Kit de Extração de DNA Vegetal.
Materiais
- CTAB tampão: 2% brometo de cetil trimetilamónio, 1% pirrolidona de polivinil, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, ou tampão de extracção CTAB
- Centrífuga (até 14.000 x g)
- RNase A Solution
- Isopropanol
- 70% Etanol
- 2 ml de tubos centrífugos
- SpeedVac
- Tampão TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Método
Amostras de plantas podem ser preparadas através da trituração criogénica de tecido num almofariz e pilão após arrefecimento em nitrogénio líquido. As plantas liofilizadas podem ser moídas à temperatura ambiente. Em ambos os casos, um pó fino é melhor para extrair DNA.
- Para cada 100 mg de tecido homogeneizado utilize 500 µl de Tampão de Extracção CTAB. Misturar e vortex bem. Transferir o homogeneizado para um banho a 60°C durante 30 minutos.
- Seguir o período de incubação, centrifugar o homogeneizado durante 5 minutos. a 14.000 x g.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Adicionar 5 µl de solução A de RNase e incubar a 37°C durante 20 minutos
- Adicionar um volume igual de álcool clorofórmio/isoamílico (24:1). Vortex durante 5 segundos e centrifugar a amostra durante 1 minuto a 14.000 x g para separar as fases. Transferir a fase superior aquosa para um novo tubo. Repita esta extração até que a fase superior esteja limpa.
- Transfira a fase superior aquosa para um novo tubo. Precipitar o DNA adicionando isopropanol frio a 0,7 volume e incubar a -20°C durante 15 minutos.
- Centrifugar a amostra a 14.000 x g durante 10 minutos. Decantar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e subsequentemente lavar com 500 µl de etanol frio a 70%. Decantar o etanol. Remover o etanol residual através da secagem em um SpeedVac.
- Seca o granulado o tempo suficiente para remover o álcool, mas sem secar completamente o ADN. Dissolver o ADN em 20 µl de tampão TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). O grânulo pode precisar de aquecimento para se dissolver.
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Protocolo opcional:
O uso de colunas de spin de sílica pode produzir ADN de maior qualidade. Para um protocolo opcional, clique aqui.