DNA metiltransferases (MTases) que transferem um grupo metilo de S-adenosilmetionina para resíduos de adenina ou citosina, são encontrados numa grande variedade de procariotas e eucariotas. A metilação deve ser considerada ao digerir o DNA com endonucleases de restrição porque a clivagem pode ser bloqueada ou prejudicada quando uma determinada base no local de reconhecimento é metilada.
Metilação cariótica
Em procariotas, as MTases têm sido mais frequentemente identificadas como elementos de sistemas de restrição/modificação que agem para proteger o DNA hospedeiro da clivagem pela endonucleose de restrição correspondente. A maioria das cepas de laboratório de E. coli contém três metilases de DNA específicas do local.
- Metilação-dame na posição N6 da adenina na sequência GATC (1,2).
- Metiltransferases-metiltransferases-metilação-Dcm na posição C5 da segunda citosina nas sequências CCAGG e CCTGG (1,3).
- EcoKI metilase-metilação da adenina nas sequências AAC(N6)GTGC e GCAC(N6)GTT.
alguns ou todos os locais para uma endonuclease de restrição podem ser resistentes à clivagem quando isolados das estirpes que expressam as metilases de Dam ou Dcm se o local de reconhecimento da metilase se sobrepuser ao local de reconhecimento da endonuclease. Por exemplo, o DNA plasmídeo isolado da barragem + E. coli é completamente resistente à clivagem por MboI, que se clivam nos locais GATC.
Nem todo o DNA isolado de E. coli é metilado na mesma extensão. Enquanto o DNA pBR322 é totalmente modificado (e por isso é completamente resistente à digestão MboI), apenas cerca de 50% dos sites λ DNA Dam são metilados, presumivelmente porque a metilase não tem a oportunidade de metilar o DNA completamente antes de ser embalado na cabeça do fago. Como resultado, as enzimas bloqueadas pela modificação de Dam ou Dcm produzirão padrões de digestão parcial com λ DNA.
Locais de restrição que são bloqueados pela metilação de Dam ou Dcm podem ser desmetilados pela clonagem do seu DNA em uma cepa de E. coli, como dam-/dcm- E. coli competente (NEB #C2925).
Locais de restrição também podem ser bloqueados se um local sobreposto estiver presente. Neste caso, parte da sequência da barragem ou Dcm é gerada pela sequência da enzima de restrição, seguida pela sequência de flanqueamento. Esta situação também deve ser considerada ao projetar digestores de enzimas de restrição.
Metilação eucariótica
CpG MTases, encontradas em eucariotas superiores (por exemplo, Dnmt1), transfira um grupo metilo para a posição C5 de resíduos de citosina. Os padrões de metilação CpG são hereditários, específicos dos tecidos e correlacionados com a expressão gênica. Consequentemente, a metilação CpG foi postulada para desempenhar um papel na diferenciação e expressão gênica (4).
Nota: Os efeitos da metilação CpG são principalmente uma preocupação quando se digere o DNA genômico eucariótico. Os padrões de metilação da CpG não são retidos quando o DNA é clonado em um hospedeiro bacteriano.
Sensibilidade à metilação
A tabela abaixo resume a sensibilidade à metilação para enzimas de restrição NEB, indicando se a clivagem é bloqueada ou prejudicada por Dam, Dcm ou metilação CpG se ou quando ela se sobrepõe a cada local de reconhecimento. Esta tabela deve ser vista como um guia para o comportamento das enzimas listadas em vez de um indicador absoluto. Consulte REBASE , o banco de dados de enzimas de restrição, para informações mais detalhadas e exemplos específicos nos quais estas diretrizes são baseadas.
- Marinus, M.G. e Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143–1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.e Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408–1413. PMID: 368070
- May, M.S. e Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768–770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. e Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legend
| ● | Não sensível | ◆ | Imparado |
| ◼ | bloqueado | ◇ ol | Imparado por Sobreposição |
| ◻ ol | Bloqueado por Sobreposição | ◇ scol | Imparado por Algumas Combinações de Sobreposição |
| ◻ scol | Bloqueado por Algumas Combinações de Sobreposição | ||
Código de Letra Única