O Método Sanger é usado para amplificar um segmento alvo de ADN, para que a sequência de ADN possa ser determinada com precisão. A incorporação de ddNTPs nas válvulas de reacção é simplesmente utilizada para terminar a síntese de um segmento de ADN em crescimento, resultando em fragmentos de ADN parcialmente replicados. Isto porque a DNA polimerase requer o grupo 3′ OH da cadeia de crescimento e o grupo 5′ fosfato do dNTP que entra para criar uma ligação fosfodiéster. Algumas vezes a DNA polimerase incorpora um ddNTP e a ausência do grupo 3′ OH interromperá a reação de condensação entre o fosfato de 5′ (após a clivagem do pirofosfato) do nucleotídeo que entra com o grupo 3′ hydroxyl do nucleotídeo anterior no cordão de crescimento. Esta reação de condensação ocorreria normalmente com a incorporação de um dNTP não modificado por DNA polimerase. Em termos mais simples, o ataque nucleófilo dos leds do grupo 3′ OH à adição de um nucleotídeo a uma cadeia de crescimento. A ausência do grupo 3′ hydroxyl inibe este ataque nucleófilo de acontecer, incapacitando a capacidade das DNA polimerases de continuar com a sua função.
Esta descoberta levou ao seu nome apropriado “Nucleotídeos Terminadores de Cadeia”. Os dideoxirribonucleotídeos não têm um grupo hidroxila de 3′, portanto não pode ocorrer alongamento adicional da cadeia uma vez que este dideoxinucleotídeo esteja na cadeia. Isto pode levar ao término da sequência de ADN. Assim, estas moléculas formam a base do método de terminação da cadeia de dideoxy do sequenciamento de DNA, que foi relatado por Frederick Sanger e sua equipe em 1977 como uma extensão do trabalho anterior. A abordagem de Sanger foi descrita em 2001 como um dos dois métodos fundamentais para sequenciar fragmentos de ADN (sendo o outro o método Maxam-Gilbert), mas o método Sanger é tanto o “mais utilizado como o método utilizado pela maioria dos sequenciadores de ADN automatizados”. Sanger ganhou o segundo Prêmio Nobel de Química dele em 1980, compartilhando isto com Walter Gilbert (“para as contribuições deles/delas a respeito da determinação de seqüências de base em ácidos nucléicos”) e com Paul Berg (“para os estudos fundamentais dele da bioquímica de ácidos nucléicos, com particular consideração para recombinant-DNA”), e discutiu o uso de dideoxinucleotides na palestra Nobel dele.
DNA SequencingEdit
Os dideoxinucleótidos são úteis no sequenciamento de DNA em combinação com electroforese. Uma amostra de DNA que é submetida a PCR (reacção em cadeia da polimerase) numa mistura contendo os quatro desoxinucleótidos e um dideoxinucleótido produzirá fios de comprimento igual à posição de cada base do tipo que complementa o tipo com um dideoxinucleótido presente. A taq polimerase utilizada em PCR favorece a ddGNTP, que tem sido um padrão observado em várias pesquisas. Ou seja, cada base de nucleotídeo desse tipo particular tem uma probabilidade de estar ligada não a um desoxinucleotídeo mas sim a um dideoxinucleotídeo, o que termina o alongamento da cadeia. Portanto, se a amostra for submetida à eletroforese, haverá uma faixa presente para cada comprimento em que o complemento do dideoxinucleotídeo estiver presente. Agora é comum o uso de dideoxinucleotídeos fluorescentes de tal forma que cada um dos quatro tem uma fluorescência diferente que pode ser detectada por um seqüenciador; assim, apenas uma reação é necessária.