4.3 Da vesícula da lente à lente madura
A vesícula da lente forma-se fechando o copo da lente (também conhecido como fosso da lente) e separando-se da ectoderme da superfície. Um passo intermediário é o desenvolvimento de um talo de lente mantendo a vesícula fechada e a ectoderme de superfície juntas por algumas horas (no mouse). A vesícula da lente é quase esférica com uma grande cavidade central; as células do seu pólo posterior são alongadas até atingirem as células epiteliais anteriores e preencherem toda a vesícula da lente; estas células alongadas são referidas como células de fibra de lente primária. Esta etapa ocorre por volta do 44º dia de gestação em embriões humanos e no E11.5 no rato (Fig. 10.5). As células no pólo anterior da vesícula do cristalino permanecem como células epiteliais. As células mitologicamente ativas ao redor da região central do epitélio do cristalino movem-se para a região equatorial (ou região do arco do cristalino), onde se alongam e se diferenciam em fibras secundárias do cristalino. A linha média, onde as fibras do cristalino secundário de pontos opostos do equador se juntam, é chamada de sutura do cristalino anterior e posterior. As fibras das lentes secundárias formam camadas concêntricas ao redor das fibras primárias do núcleo do cristalino (no rato no dia E15.5; Fig. 10.5). Com essa disposição, as fibras da lente em direção à periferia são sucessivamente mais jovens em termos de desenvolvimento e diferenciação. Enquanto a lente cresce, novas fibras secundárias se movem do equador para o córtex externo da lente.
Figure 10.5. Formação da lente. Uma vez formada a vesícula da lente, as fibras da lente primária se alongam do epitélio posterior da vesícula da lente e preenchem todo o seu lúmen. As células das fibras secundárias começam a se alongar na região do arco da lente; as fibras de lados opostos se encontram no pólo anterior e posterior, e dão origem às suturas da lente (que são em forma de Y na visão tridimensional). O passo final na diferenciação da lente é a degradação dos núcleos celulares e mitocôndrias, que ocorre por volta da hora do nascimento no rato (modificado de acordo com Graw, 2003; com permissão do Grupo Editorial Nature).
As células das fibras primárias e secundárias perdem suas mitocôndrias e núcleos celulares durante o processo final de diferenciação: para as fibras primárias, ocorre em ratos na E17/E18 e é finalizada 2 semanas após o nascimento, quando os ratos abrem suas pálpebras (Vrensen et al, 1991). As células de fibra secundária, que circundam as células de fibra primária, perdem suas organelas, quando se movem do córtex externo para o interno (Kuwabara e Imaizumi, 1974).
As células epiteliais anteriores, entretanto, permanecem mitologicamente ativas como um nicho de células-tronco produzindo células de fibra secundária. Estas células de fibra óptica secundária são células terminalmente diferenciadas e perdem suas organelas também, quando são pressionadas mais profundamente dentro da lente pelas sucessivas células de fibra.
No zebrafish, entretanto, várias diferenças no desenvolvimento e diferenciação da lente ocorrem. Em particular, o alongamento das células da fibra primária ocorre de forma circular, resultando em um núcleo embrionário da lente com conchas concêntricas de fibras. O espaçamento muito próximo dos núcleos das fibras secundárias diferenciadoras em uma zona estreita próxima ao epitélio equatorial, no entanto, sugere que a diferenciação celular das fibras secundárias se desvia da descrita para as lentes de mamíferos ou de aves. Devido a essas diferenças, deve-se ser cauteloso ao extrapolar os achados sobre o zebrafish para o desenvolvimento ou função da lente do rato ou humano (Dahm et al., 2007).
Em ratos, pelo menos dois genes, Pitx3 e Foxe3, caracterizam a importância da natureza transitória do estágio de talo da lente. Em embriões de camundongos, Pitx3 é expresso na lente em desenvolvimento a partir da E11, primeiro na vesícula da lente, e depois no epitélio anterior e no equador da lente. Mutações nas regiões regulatórias ou codificantes do gene Pitx3 têm demonstrado causar o fenótipo de mutantes de ratos afáticos (ak) ou sem olhos (eyl), que não têm lentes e pupilas (Rieger et al., 2001; Rosemann et al., 2010; Semina et al., 2000). Nesses ratos, o talo da lente persiste por vários dias, levando finalmente a uma degradação da vesícula rudimentar da lente, e o tecido da retina preenche todo o globo ocular. Como Pitx3 também é expresso em neurônios dopaminérgicos da substantia nigra, esses ratos também são excelentes modelos para a doença de Parkinson (Rosemann et al., 2010). Em contraste com o rato, as mutações no PITX3 humano causam disgenesia mesenquimal do segmento anterior (ASMD; Semina et al., 1998).
Os ratos ak/ak têm um fenótipo ocular que é muito semelhante ao dos ratos dyl (lente disgenética), indicando que ambos os genes estão envolvidos no mesmo processo biológico. Blixt et al. (2000) mostraram que o fenótipo dyl é mediado por uma mutação no gene Foxe3. No rato, o FoxE3 é expresso no olho em desenvolvimento em torno do E9.5, no início da indução do placódio da lente (Fig. 10.2). À medida que se forma o placódio da lente, a expressão do FoxE3 aumenta e fica confinada à vesícula da lente à medida que esta se desprende do ectoderma de superfície. Duas mutações dentro do domínio de ligação de ADN do FoxE3 foram identificadas em ratinhos dyl. Em humanos, as mutações no FOXE3 são responsáveis pela disgenesia óptica do segmento anterior (ASOD). Devido ao padrão de expressão do FOXE3 e ao fenótipo variável dos ratos dyl heterozigotos, uma pequena coorte de pacientes com anomalia de Peters nos quais não foi possível detectar mutações de PAX6 foi rastreada para mutações de FOXE3. Um dos pacientes acabou sendo heterozigoto para uma substituição Arg90Leu afetando o domínio de ligação de DNA de FOXE3 (Ormestad et al., 2002).
O segundo passo importante é o alongamento das células na metade posterior da vesícula da lente preenchendo-a com células de fibra primária. No rato mutante “manchas opacas no cristalino”, uma mutação pontual afeta a região básica de Maf (codificada por um oncogene, responsável pelo fibrossarcoma musculoaponeurotico) e impede a formação correta das fibras do cristalino primário levando a um fenótipo semelhante ao da catarata pulverulenta em uma família humana (Lyon et al., 2003). MAF mamífero é expresso no placódio e na vesícula do cristalino e, posteriormente, nas fibras do cristalino primário.
Similiarmente, Puk et al. (2008) recentemente caracterizaram um novo etil nitroso-urea (ENU)-induzido mutante de rato com um fenótipo de olho pequeno e uma vesícula vazia do cristalino no estado homozigoto. Neste caso, foi identificada uma mutação no gene Gjf1 (também referido como Gje1). No rato, o gene Gjf1 codifica uma proteína connexina de 23,8 kDa, que é expressa na parte posterior da vesícula do cristalino, onde começa o alongamento da fibra primária. Nos mutantes, o padrão de expressão de Pax6, Prox1, Six3 e Crygd são modificados, mas não o padrão de Pax2. O gene Gjf1 é considerado essencial para a formação das fibras da lente primária (Puk et al., 2008) e pode ser considerado um alvo a jusante do fator de transcrição c-Maf; mutações no gene Maf correspondente levam a um fenótipo semelhante no rato (Lyon et al., 2003; Perveen et al., 2007). Atualmente, não está claro se existe uma contraparte humana funcional do gene Gjf1 do rato.
Um terceiro fenótipo sem alongamento das fibras da lente primária é causado pelo knockout do gene Pparbp (codificação para a proteína de ligação do receptor do ativador do proliferador peroxisoma; Crawford et al., 2002). A relação entre estas três proteínas funcionalmente distintas para a formação das células da fibra óptica primária ainda não é clara.
Além destes três genes, Wnt signaling pode também desempenhar um papel no alongamento das células da fibra primária. Faber et al. relataram em 2002 uma forma dominantemente negativa do Bmp-receptor 1b (símbolo do gene: Bmpr1b) em camundongos transgênicos. Esses mutantes transgênicos de camundongos mostram uma inibição do desenvolvimento da célula de fibra primária, entretanto, de forma assimétrica: ela apareceu apenas no lado nasal da lente na metade ventral. Os autores concluíram que estímulos de diferenciação distintos podem estar ativos em diferentes quadrantes.
No lado anterior, as células epiteliais do cristalino permanecem como as únicas células mitóticas ativas no cristalino. Elas são caracterizadas por uma expressão contínua de vários genes Wnt: entretanto, os dados detalhados de expressão relatados não são apenas diferentes entre pintinhos e ratos, mas variam também entre diferentes linhagens de ratos (para detalhes, veja uma revisão de de Iongh et al., 2006). No entanto, permanece claro que os genes da via de sinalização de Wnt são expressos predominantemente nas células epiteliais da lente. Consistentemente, os receptores Fzd (símbolos genéticos: Fzd1-8) e os co-receptores Lrp5 e Lrp6, Sfrp1-3 e Dkk1-3 também foram demonstrados a serem expressos durante o desenvolvimento das lentes. Eles estão presentes principalmente nas células epiteliais; a única exceção é o Fzd6 ser cada vez mais expresso em células de fibras diferenciadas (de Iongh et al., 2006). Como exemplo, lrp6 mutantes nulos foram analisados mostrando (além de alguns outros defeitos; veja MGI database) pequenos olhos e lentes aberrantes caracterizados por um epitélio anterior incompletamente formado, resultando na extrusão das fibras da lente no estroma córneo sobrejacente (Stump et al., 2003).
No entanto, o gatilho chave para a diferenciação das células das fibras da lente é a sinalização de Fgf. Um dos resultados mais significativos demonstrados em explantes de lentes de rato é que diferentes concentrações de Fgf2 (anteriormente conhecidas como “Fgf básico” ou “bFGF”) são responsáveis pela proliferação, migração e diferenciação das células das células das lentes (McAvoy e Chamberlain, 1989). Como ainda não se sabe quais dos vários Fgfs estão envolvidos na indução da lente (Smith et al., 2010), a pesquisa se concentrou nos receptores Fgf. Como mencionado acima, defeitos graves no alongamento das células das fibras das lentes ocorreram em lentes sem três genes receptores Fgf (Fgfr1-3; Zhao et al., 2008). A sinalização de Fgf também é necessária para a iniciação da via não-canônica Wnt (ou seja independente da β-catenin) em células epiteliais da lente; em explantes de lente, leva ao acúmulo de β-crystallin, um marcador para diferenciação de células de fibra (Lyo e Joo, 2004).
A lente madura contém várias classes de proteínas estruturais: as cristalinas (α-, β-, γ-, γ-, μ-, ζ-crystallins), proteínas transmembranas (como MP19 e MIP26, e as connexinas 43, 46, e 50), alguns colágenos, e proteínas de filamentos citoesqueletais e intermediários. As mutações nos genes correspondentes (ou factores específicos de transcrição) levam a desequilíbrios funcionais e opacidades das lentes (cataratas). A idade de início das cataratas e o seu modo de herança dependem da expressão dos genes correspondentes e do domínio que é afectado pela mutação subjacente. No total, sabe-se que existem diferentes genes responsáveis pela formação da catarata em ratos e seres humanos, ∼60. Uma discussão detalhada das mutações correspondentes e suas consequências funcionais está além do escopo deste capítulo; revisões correspondentes a este tópico em particular foram publicadas recentemente pelo autor (Graw, 2009a,b).