Abstract
O stress oxidativo tem sido implicado em várias patologias, incluindo hipertensão, aterosclerose, diabetes, e doença renal crônica. O trabalho atual foi concebido com o objetivo de investigar os potenciais antioxidantes cobre, manganês e zinco no tratamento da hipertensão em ratos Wistar. Os ratos foram alimentados com 8% de NaCl em dieta durante 5 semanas e tratamento com suplementos na presença do agente desafiador por mais 4 semanas. A suplementação diminuiu significativamente a pressão arterial em comparação com o controle da hipertensão. O resultado também indicou uma diminuição significativa dos níveis de colesterol total, triglicéridos, colesterol lipoproteico de baixa densidade e colesterol lipoproteico de muito baixa densidade, malondialdeído, insulina e aumento do colesterol lipoproteico de alta densidade, atividades antioxidantes totais e óxido nítrico dos grupos suplementados em relação ao controle hipertensivo. A porcentagem média de proteção contra a aterogênese indicou 47,13 ± 9,60% para todos os grupos suplementados. A pressão arterial média mostrou correlação positiva significativa com glicose, colesterol total, triglicérides, colesterol lipoproteico de baixa densidade, colesterol lipoproteico de muito baixa densidade, índice aterogênico, resistência à insulina e malondialdeído, enquanto que o colesterol lipoproteico de alta densidade e as atividades antioxidantes totais mostraram correlação negativa. O resultado, portanto, indicou forte relação entre estresse oxidativo e hipertensão e ressalta o papel dos minerais antioxidantes na redução do estresse oxidativo, dislipidemia e resistência à insulina associada à hipertensão.
1. Introdução
Hipertensão é uma das doenças mais comuns no mundo e uma das principais causas de morte por insuficiência cardiovascular. Devido à morbidade e mortalidade associadas, a hipertensão é um problema de saúde pública e, portanto, a necessidade de buscar estratégias adequadas de prevenção e manejo deve ser a preocupação dos profissionais de saúde. O aumento do estresse oxidativo vascular pode estar envolvido na patogênese da hipertensão, um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares e mortalidade nos países desenvolvidos e em desenvolvimento. O início da hipertensão é causado por complexas interações entre a predisposição genética e fatores ambientais. O aumento da ingestão de sal pode agravar o aumento da pressão arterial e o desenvolvimento de conseqüentes danos aos órgãos finais .
O novo conceito de que anormalidades estruturais e funcionais na vasculatura, incluindo disfunção endotelial, aumento do estresse oxidativo, e diminuição das atividades antioxidantes, podem antever a hipertensão e contribuir para a sua patogênese, ganhou suporte nos últimos anos . Estudos com animais têm geralmente apoiado a hipótese de que o aumento da pressão sanguínea está associado ao aumento do estresse oxidativo. Foram relatados em indivíduos hipertensos, subprodutos da peroxidação lipídica elevada e diminuição da atividade dos sistemas antioxidantes . Vários estudos têm indicado um aumento nos níveis de hipertensão e implicado NADPH oxidase como fonte de excesso .
Angiotensina II demonstrou ser um potente ativador da atividade da NADPH oxidase na musculatura lisa vascular, células endoteliais e cardiomiócitos . Um achado comum em todos os tipos de hipertensão, bem como diabetes e síndrome metabólica é a disfunção endotelial, caracterizada por um desequilíbrio na expressão e sensibilidade aos agentes vasodilatadores e vasoconstritores resultando em aumento do tônus vascular e, portanto, um aumento na resistência ao fluxo .
Cobre, manganês e zinco são comumente referidos como minerais antioxidantes que são necessários para a atividade de algumas enzimas antioxidantes. Hiroyuki et al. relataram que a deficiência de zinco pode ter um papel crucial no desenvolvimento da hipertensão genética presumivelmente através do estresse oxidativo causado pela hipertensão. Sabe-se que o ânion superóxido inativa rapidamente o vasodilatador derivado do endotélio, o óxido nítrico, promovendo assim a vasoconstrição. Consequentemente, as tentativas de neutralizar os efeitos hipertensivos das espécies reativas de oxigênio levaram ao uso de antioxidantes exógenos para melhorar a função vascular e reduzir a pressão sanguínea em modelos animais e a hipertensão humana. Assim, a avaliação do potencial efeito dos antioxidantes cobre, manganês e zinco no manejo da hipertensão é a base deste estudo.
2. Métodos
2.1. Químicos e Reagentes
Químicos e reagentes com classificação analítica foram utilizados para esta pesquisa. Sulfato de cobre e sulfato de manganês foram obtidos de maio e Baker, Inglaterra, enquanto sulfato de zinco foi obtido de J.T. Baker chemical company, Philipsburg, New Jersey.
2.2. Animais Experimentais
Ratos wistar machos pesando entre 150-180 g foram adquiridos da Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Usmanu Danfodiyo, Sokoto, Nigéria e foram autorizados a se aclimatar por duas semanas antes do início da experiência. Os animais foram agrupados em seis grupos de 5 ratos cada e foram alimentados com ração peletizada de produtores (Vital feed, Jos, Nigéria) e permitiram o acesso à água ad libitum durante todo o período experimental. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Usmanu Danfodiyo, Sokoto, Nigéria.
2.3. Indução de Hipertensão
Os ratos foram colocados em uma dieta rica em sal (8% NaCl), exceto controle normotensivo por 9 semanas, adicionando 8% de NaCl à ração. O tratamento foi iniciado a partir da 6ª semana de carregamento de sal.
2.4. Medição da pressão arterial
A pressão do sangue foi monitorizada semanalmente pelo método de algema da cauda usando o Ugo Basile não-invasivo, série 58500 Registrador de Pressão Sanguínea. A média de quatro leituras foi feita para cada rato, e a temperatura do rato foi monitorizada ao longo do período de medição. A pressão arterial média foi calculada de acordo com a seguinte equação: onde SP e DP são pressão sistólica e diastólica, respectivamente.
2,5. Preparação de Suplementos
Cobre, manganês e zinco foram preparados dissolvendo sulfato de cobre, sulfato de manganês e sulfato de zinco em água destilada para obter 2,5 mg/mL de cobre, 2,4 mg/mL de manganês e 11 mg/mL de zinco, respectivamente. Todos os suplementos foram preparados pouco antes da administração.
2,6. Agrupamento de Animais e Tratamento
Grupo I Água normal não tratada /destilada. Grupo II Controle Hipertensivo/Água destilada. Grupo III Salinidade tratada com 4 mg/kg de cobre. Grupo IV Sal carregado tratado com 10 mg/kg de manganês. Grupo V Sal com tratamento de 20 mg/kg de zinco. Grupo VI Sal – Carga salgada tratada com 4 mg/kg de cobre, 10 mg/kg de manganês e 20 mg /kg de zinco.
As concentrações dos suplementos foram seleccionadas com base na dose diária recomendada e nas doses adequadas administradas oralmente aos grupos tratados de acordo com o seu peso corporal por intubação com tubo de cânula intravenoso durante 4 semanas. Vinte e quatro horas após o último tratamento, os animais foram anestesiados com vapor de clorofórmio e amostras de sangue em jejum foram coletadas através de punção cardíaca em tubos rotulados para análises bioquímicas. As alterações de peso dos ratos foram monitorizadas ao longo do período experimental.
2.7. Estimação dos Parâmetros Bioquímicos
A amostra de sangue foi permitida a coagulação e centrifugação a 4000 g durante dez minutos e o soro obtido foi utilizado para a estimativa da glicose, perfil lipídico, estado antioxidante total, insulina, superóxido dismutase, catalase e óxido nítrico. Os animais foram sacrificados e o fígado de cada rato foi dissecado, enxaguado com solução salina gelada para remover o sangue. Foi preparado um homogeneizado a 10% em tampão Tris 0,1 M gelado, pH 7,4 usando um homogeneizador. O homogeneizado foi centrifugado a 4000 g durante 15 minutos. Os sobrenadantes foram usados para estimativa da substância reativa ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e da atividade de peroxidase de glutationa.
O nível sérico de glicose em jejum foi estimado pelo método da glicose oxidase. O colesterol total sérico, triglicéridos e colesterol lipoproteico de alta densidade foram determinados pelo método enzimático.
Colesterol lipoproteico de baixa densidade e colesterol lipoproteico de muito baixa densidade foi calculado pela fórmula de friedewald et al. O índice aterogênico foi calculado como a relação entre o colesterol LDL e o colesterol HDL .
O método colorimétrico foi usado para a estimativa do status sérico de antioxidante total e malondialdeído tecidual .
Cayman’s Superoxide Dismutase Assay Kit foi usado para a estimativa da SOD. O ensaio utiliza um sal de tetrazólio para a detecção de radicais superóxidos gerados pela xantina oxidase e hipoxantina a 450 nm. Uma unidade de SOD é definida como a quantidade de enzima necessária para exibir 50% de dismutação dos radicais superóxidos.
A atividade catalítica foi estimada usando o Kit de Ensaio de Catalase de Cayman. O método é baseado na reação da enzima com metanol na presença de uma concentração ótima de H2O2. O formaldeído produzido é medido com 4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (Purpald) como o cromogéneo a 540 nm.
Atividade de glutationa peroxidase foi testada usando o Cayman’s Assay Kit. Este ensaio mede a actividade do glutatião peroxidase indirectamente através de uma reacção acoplada com glutatião redutase. O glutatião oxidado, produzido após redução do hidroperóxido pelo glutatião peroxidase, é reciclado ao seu estado reduzido pela glutatião redutase e NADPH. A oxidação do NADPH para NADP+ é acompanhada por uma diminuição da absorção a 340 nm.
Oxido nítrico foi estimado pelo Kit de Ensaio de Cayman. O ensaio fornece um método preciso e conveniente para a medição da concentração total de nitrato/nitrito em um processo simples de dois passos. O primeiro passo é a conversão de nitrato em nitrito utilizando nitrato redutase. A segunda etapa é a adição do reagente Griess que converte nitrito em um composto azoto roxo profundo.
Insulina foi estimada pelo SPI biorat insulin enzyme immunoassay kit. O ensaio é baseado na competição entre insulina de rato não rotulada e acetilcolinesterase ligada à insulina de rato (traçador) para locais específicos limitados de antissoro de insulina de porco-da-índia anti-rato. A placa foi então lavada e o reagente de Ellman adicionado aos poços, e o marcador de acetilcolinesterase age sobre o reagente de Ellman para formar um composto amarelo que foi determinado a 405 nm.
Insulin resistance index was calculated by Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance (HOMA-IR) . A porcentagem de proteção contra a aterogênese foi calculada usando a seguinte equação
2,8. Análise estatística
Valores são expressos como desvio padrão médio para 5 ratos em cada grupo. O resultado foi analisado estatisticamente usando a análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett usando o software GraphPad Instat. As diferenças foram consideradas significativas quando .
3. Resultados
O ganho de peso de ratos (Figura 1) indicou que o controle com carga de sal sem tratamento ganha mais peso () do que os grupos tratados e o controle normotensivo. A suplementação mostrou efeito significativo () nas alterações de peso dos ratos em relação ao controle hipertensivo.
Houve aumento significativo () na pressão arterial média dos ratos carregados com sal (Figura 2). A suplementação causou diminuição significativa na pressão arterial média dos grupos tratados em relação ao controle hipertensivo.
A percentagem média de redução da pressão arterial dos grupos suplementados. SBP: pressão arterial sistólica, DBP: pressão arterial diastólica, MABP: pressão arterial média, Grp III: carregada de sal tratada com cobre, Grp IV: carregada de sal tratada com manganês, Grp V: carregada de sal tratada com zinco e Grp VI: carregada de sal tratada com minerais combinados. e ns: não significativa quando comparada com Grp VI.
A carga de sal causou aumento significativo na glicose sérica, insulina e resistência à insulina (Tabela 1), e suplementações com os elementos minerais revertem a tendência.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HOMA-RI: Avaliação do Modelo de Homeostasia – Resistência à insulina, controle I-normotensivo, controle II-hipertensivo, grupo III tratado com cobre, grupo IV tratado com manganês, grupo V tratado com zinco, grupo VI tratado com todos os minerais. Valores são expressos como Média ± DP; . quando comparados com grp II, quando comparados com grp II, quando comparados com grp I, quando comparados com grp I pelo teste de comparação múltipla de Dunnette. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Efeito da suplementação no perfil lipídico sérico e índice aterogênico é apresentado na Tabela 2. O resultado indicou uma diminuição significativa nos níveis de TC, TG, LDL-C, VLDL-C e AI e um aumento no HDL-C em comparação com o grupo sem tratamento com sal.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| TC: colesterol total, TG: triglicérido, HDL-C: colesterol lipoproteico de alta densidade, LDL-C: colesterol lipoproteico de baixa densidade, VLDL-C: colesterol lipoproteico de muito baixa densidade, AI: índice aterogênico, I: controle normotensivo, II: controle hipertensor, III: grupo tratado com cobre, IV: grupo tratado com manganês, V: grupo tratado com zinco, e VI: grupo tratado com todos os minerais. Valores são expressos como Média ± DP; . quando comparados com o grupo II, quando comparados com grp II, quando comparados com o grupo I, e quando comparados com o grupo I pelo teste de comparação múltipla de Dunnette. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A % de proteção contra aterogênese (Figura 4) indicou aumento significativo () na % de proteção no grupo suplementado com minerais combinados em relação aos grupos cobre, manganês e zinco. O grupo tratado com minerais combinados mostrou a maior proteção de 60,79% enquanto que o grupo suplementado com manganês mostrou a menor proteção de 38,76%.
Efeito da suplementação no estado antioxidante total, óxido nítrico e MDA (Tabela 3) mostraram aumento significativo nos níveis de TAS entre o grupo não tratado e os grupos manganês () e mineral combinado (). O resultado também indicou uma diminuição significativa () no MDA tecidual dos grupos suplementados em comparação com o controle sem tratamento. A função endotelial também foi melhorada após a suplementação.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
O resultado do efeito da suplementação nas enzimas antioxidantes é apresentado na Tabela 4. O resultado indicou que a suplementação aumentou as atividades do gato, Gpx, e SOD em comparação com o controle hipertensivo.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GPx: glutationa peroxidase, SOD: superóxido dismutase, I: controle normotensivo, II: controle hipertensivo, III: grupo tratado com cobre, IV: grupo tratado com manganês, V: grupo tratado com zinco, e VI: grupo tratado com todos os minerais. Valores são expressos como Média ± DP; . quando comparado com o grupo II, quando comparado com o grupo II, quando comparado com o grupo I, e quando comparado com o grupo I pelo teste de comparação múltipla de Dunnette. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coeficiente de correlação () da MABP contra glicose, resistência à insulina, perfil lipídico e marcadores de estresse oxidativo é apresentado na Figura 5. O resultado mostrou correlação positiva significativa entre MABP e glicose, insulina, resistência à insulina, TC, TG, LDL-C, VLDL-C, AI e MDA enquanto HDL-C, TAS, SOD, Cat, e GPx mostraram correlação negativa com MABP.
4. Discussão
Hipertensão está entre os fatores de maior risco para doenças cardiovasculares . Neste modelo, uma dieta contendo 8% de NaCl foi utilizada para induzir hipertensão em ratos wistar por 5 semanas e uma dieta com suplemento de sal por mais 4 semanas. Tem sido relatado que o sal elevado causa hipertensão em ratos . O mecanismo pelo qual as dietas com alto teor de sal induzem hipertensão pode ser devido ao aumento do nível de sódio circulante, que causa a liberação de água pelas células devido à pressão osmótica, que eleva a pressão nas paredes dos vasos sanguíneos. Outros possíveis mecanismos poderiam ser em parte devido a um aumento da capacidade do plasma de inibir, -Adenosina trifosfotase, que aumenta a pressão sanguínea ao inibir a bomba de troca sódio-cálcio no músculo liso vascular, ou que a dieta de sódio está associada ao aumento da angiotensina II intrarrenal que pode resultar em vasoconstrição renal e aumento da produção renal devido à ativação da NADPH oxidase. A superprodução de ânions superóxidos e outros radicais livres devido à ativação da NADPH oxidase pode sobrecarregar a capacidade antioxidante e causar desequilíbrios entre o estado oxidante e antioxidante, o que pode resultar em estresse oxidativo. O resultado indicou que a carga de sal aumentou a pressão arterial dos ratos e a suplementação com minerais antioxidantes impede a elevação da pressão sanguínea. A observação confirma o relatório de que a carga de sal em várias estirpes de ratos como os ratos Sprague-Dawley e os ratos wistar resultam em aumento da pressão arterial.
O grupo suplementado com minerais combinados quase normalizou a pressão arterial média, o que indica que a terapia combinada parece ser mais eficaz na redução da pressão arterial do que a suplementação de um único mineral antioxidante.
O efeito de redução da pressão arterial do cobre, manganês e zinco neste modelo pode ser atribuído às suas propriedades de eliminação de radicais livres, que diminuem o óxido nítrico, que diminui o têmpera pelo ânion superóxido, diminui a actividade da NADPH oxidase, ou aumenta a actividade da superóxido dismutase, uma vez que estes minerais formam uma parte essencial e integral da superóxido dismutase. O resultado do trabalho atual confirma o relatório que a suplementação de zinco baixa a pressão arterial de ratos hipertensos carregados com sal.
O aumento dos níveis de triglicéridos, colesterol total, colesterol lipoproteico de baixa densidade, colesterol lipoproteico de muito baixa densidade e diminuição do colesterol lipoproteico de alta densidade observado em ratos hipertensivos em comparação com o grupo suplementado corroborou com vários estudos . O possível mecanismo subjacente à relação entre aumento dos níveis de colesterol HDL e diminuição do colesterol LDL e resultado cardiovascular da hipertensão após a suplementação neste estudo pode ser devido ao aumento da síntese ou diminuição da degradação do colesterol HDL que pode diminuir as espécies lipídicas oxidadas nas partículas LDL, protegendo-as assim da aterogênese. Isto pode, de facto, reflectir o ponto de partida para a protecção contra a aterosclerose. O resultado também mostrou diminuição dos níveis de glicose, insulina, resistência à insulina, malondialdeído e aumento do óxido nítrico dos grupos suplementados, em comparação com o controle hipertensivo. A melhora da função endotelial e da sensibilidade insulínica observada nos grupos suplementados confirma o papel do cobre antioxidante, manganês e zinco no controle da hipertensão. Assim, os mecanismos moleculares exatos subjacentes aos efeitos antioxidantes desses minerais na sensibilidade insulínica e na função endotelial não foram totalmente determinados nesse modelo, mas puderam ser mediados através da supressão do estresse oxidativo, o que resultou na melhoria do status antioxidante e da função endotelial, como evidenciado pela diminuição do índice de peroxidação lipídica, malondialdeído e aumento do óxido nítrico, uma medida da função endotelial.
Os resultados do estudo sugerem que a carga de sal induz a hipertensão via estresse oxidativo, uma vez que elicida a peroxidação lipídica e influencia, as atividades das enzimas antioxidantes nos ratos. Isto é indicado pelo aumento do status antioxidante total e das atividades da superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase após a suplementação com minerais antioxidantes, que foi sobrecarregada devido ao estresse oxidativo induzido pelo sal.
Também foi feita uma tentativa de correlacionar a pressão arterial média com todos os parâmetros bioquímicos avaliados em nosso modelo, a fim de determinar o grau de associação entre estas variáveis. O resultado indicou correlação positiva significativa entre pressão arterial média e glicose, colesterol total, triglicérides, colesterol lipoproteico de baixa densidade, colesterol lipoproteico de muito baixa densidade, índice aterogênico, resistência à insulina e malondialdeído, enquanto o colesterol lipoproteico de alta densidade, status antioxidante total, catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase apresentaram correlação negativa significativa.
A correlação positiva entre MABP e malondialdeído sugere que o aumento da pressão arterial resultou em maior produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, e a suplementação diminuiu tanto a MABP quanto o MDA. A correlação negativa entre a MABP e o status antioxidante total, catalase, SOD e glutationa peroxidase é uma evidência de que o aumento da MABP diminuiu as atividades dessas enzimas e diminuiu a TAS que poderia ser atribuída à produção de excesso de radicais livres, mas a suplementação melhora, os efeitos.
Estas observações confirmaram ainda mais o papel do estresse oxidativo na hipertensão, e as suplementações com minerais antioxidantes têm o potencial de prevenir ou retardar as complicações cardiovasculares da hipertensão, uma vez que nossos resultados fornecem proteção antioxidante. Entretanto, não está claro se o aumento da quantidade de espécies reativas de oxigênio é uma consequência da hipertensão ou não.
5. Conclusão
O resultado confirmou o papel do estresse oxidativo na hipertensão e ressalta o papel do cobre, manganês e zinco no retardo e tratamento das complicações cardiovasculares da hipertensão.