Enzimas antioxidantes, índices inflamatórios e fatores de estilo de vida em homens idosos: uma análise de coorte

Abstract

Nós examinamos a relação entre as atividades das enzimas antioxidantes no sangue, índices de estado inflamatório e uma série de fatores de estilo de vida no estudo de coorte prospectivo Caerphilly de doença cardíaca isquêmica. O estudo começou em 1979 e é baseado em uma amostra representativa da população masculina. Inicialmente 2512 homens foram vistos na fase I, e acompanhados a cada 5 anos nas fases II e III; recentemente foram vistos na fase IV. Os dados sobre classe social, hábito tabagista, consumo de álcool foram obtidos por questionário e o índice de massa corporal foi medido. As atividades das enzimas antioxidantes e os índices de estado inflamatório foram estimados por técnicas padrão. Associações significativas foram observadas para: idade com α-1-antichimotripsina (p<0,0001) e com caeruloplasmina, tanto protéica quanto oxidase (p<0,0001); hábito tabágico com α-1-antichimotripsina (p<0,0001), com caeruloplasmina, tanto protéica quanto oxidase (p<0,0001) e com glutationa peroxidose (GPX) (p<0).0001); classe social com α-1-antichimotripsina (p<0,0001), com caeruloplasmina tanto protéica (p<0,001) como oxidase (p<0,01) e com GPX (p<0,0001); índice de massa corporal com α-1-antichimotripsina (p<0,0001) e com caeruloplasmina (p<0,001). Não houve associação significativa entre o consumo de álcool e qualquer uma das enzimas sanguíneas medidas. A análise fatorial produziu um modelo com três fatores (explicando 65,9% da variação do conjunto de dados) que parecia indicar uma estreita inter-relação entre os antioxidantes.

Introdução

As doenças cardíacas isquêmicas continuam sendo a principal causa de morte na Europa e nos EUA.1 Nos últimos anos tem havido muito interesse no papel patológico dos radicais livres no desenvolvimento da aterosclerose.2-5 O corpo tem desenvolvido uma complexa estratégia de defesa para minimizar os efeitos prejudiciais de vários oxidantes. No centro desta defesa estão as enzimas antioxidantes do sangue. Elas incluem superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), glutationa peroxidase (GPX, EC 1.11.1.9), catalase (EC 1.11.1.6), e caeruloplasmina, que atuam em conjunto para proteger o organismo de danos oxidativos.6 A superóxido de eritrócito dismutase é dependente do cobre (embora o zinco tenha um papel estrutural) e acelera a dismutação do superóxido O2- a H2O2 e O2.7 A enzima glutatião peroxidase contendo selênio desintoxica H2O2 utilizando glutatião reduzido (GSH) e H2O2 como substratos para produzir H2O e glutatião oxidado (GSSG);8 o GSSG, por sua vez, é reduzido a GSH pela enzima glutatião redutase que requer NADPH como redutor; este último é fornecido através da enzima glucose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH, EC 1.1.1.49). A catalase é uma grande enzima que contém ferro ligado à hemoglucose-6-fosfato nos seus locais activos. Remove H2O2 decompondo-o directamente em O2.9 No plasma, a caeruloplasmina (oxidase) actua como um importante antioxidante na protecção do organismo contra o stress oxidativo. Esta última enzima, juntamente com a alfa-1-anticimotripsina, também é um reagente de fase aguda e pode ser usada para indicar o estado inflamatório.

As evidências acumuladas sugerem que alterações ou distúrbios nestes sistemas enzimáticos defensivos podem contribuir ou exacerbar o desenvolvimento de aterosclerose.10-12 Outros estudos examinando o efeito do envelhecimento nas atividades das enzimas antioxidantes miocárdicas e na peroxidação lipídica em ratos mostraram que a capacidade antioxidante miocárdica é enfraquecida durante o envelhecimento, aumentando a possibilidade de danos oxidativos.13 Em humanos, foi demonstrado que o tabagismo, um importante fator de risco para a aterosclerose, deprime a atividade de glutationa peroxidase plasmática.14 Os autores do estudo argumentam que o achado é consistente com a visão de que os fumantes estão sob uma carga oxidativa sustentada, e que um status antioxidante inadequado combinado com o aumento da carga de radicais livres causada pelo tabagismo pode exacerbar a oxidação do LDL e aumentar suas propriedades aterogênicas. Isto pode ser particularmente verdadeiro em uma população com alto risco de doença coronária. Diminuição da peroxidase de glutationa, da atividade de superóxido dismutase e catalase também tem sido observada em plaquetas de indivíduos com doença coronariana15 e em indivíduos com infarto agudo do miocárdio.16-17

A maioria dos estudos examinando a atividade de enzimas antioxidantes e doença cardíaca tem sido em indivíduos altamente selecionados, utilizando amostras relativamente pequenas. O estudo de coorte prospectivo de Caerphilly sobre cardiopatia isquêmica, acidente vascular cerebral e declínio cognitivo, deu a oportunidade de estudar as atividades das enzimas antioxidantes no sangue em uma amostra representativa da população masculina e explorar possíveis inter-relações entre as atividades das enzimas antioxidantes, idade, classe social, hábito tabagista e consumo de álcool.

Métodos

Uma descrição completa da coorte de Caerphilly e a coleta de dados relevantes para doenças cardíacas, acidente vascular cerebral e outras condições foi feita em outros lugares;18-21 apenas uma breve descrição é apresentada aqui. Inicialmente 2512 homens foram vistos na fase I (1979-1983), quando tinham entre 45 e 59 anos de idade. Os homens foram acompanhados posteriormente após cada período de 5 anos (nas fases II e III) e foram vistos recentemente na fase IV. Quando os homens tinham 55-69 anos de idade (fase III), foram coletadas amostras de sangue em jejum para a estimativa de vitaminas e enzimas antioxidantes do sangue. Infelizmente, os exames dos homens tinham começado alguns meses antes de surgir a oportunidade para estas estimativas e o sangue não foi obtido de algumas centenas de homens para as estimativas de antioxidantes. O plasma foi separado dos eritrócitos por centrifugação a baixa velocidade, e os eritrócitos foram lavados com soro fisiológico. Tanto o plasma quanto os eritrócitos lavados foram armazenados a -70 °C antes da análise.

As enzimas antioxidantes foram estimadas por métodos padrão como se segue. As atividades de superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glucose-6-fosfato desidrogenase foram estimadas em um auto-analisador Cobas Fara usando kits comercialmente disponíveis fornecidos pelos Laboratórios Randox. A atividade de catalisase eritrocitária foi estimada pelo método do Aebi22 usando um espectrômetro Varian Cary 1. A hemoglobina eritrocitária (Hb) foi medida por uma modificação do método descrito por Dacie e Lewis23 usando um hemoglobinômetro dedicado (Coulter Electronics). O ensaio foi calibrado utilizando o padrão de cianmethaemoglobina (HiCN), em conformidade com a norma B.S. 3985 (BDH), conforme recomendação do fabricante. As proteínas de fase aguda alfa-1-antiquimotripsina e caeruloplasmina foram estimadas usando métodos imunoturbidométricos e kits comerciais fornecidos pela Dako, com a exceção de que as alíquotas usadas para essas análises foram diluídas manualmente, ao invés de automaticamente antes do ensaio em um auto-analisador Cobas Fara. A atividade de Caeruloplasmina oxidase (CpO) foi estimada na Cobas Fara usando o dicloridrato de p-fenilenodiamina como substrato.24 As variações intra e interlotes foram <6,5% para todos os analitos medidos.

Dados adicionais, incluindo hábito de fumar, classe social, consumo de álcool e índice de massa corporal foram coletados por questionário e medição física, respectivamente; detalhes completos foram descritos anteriormente.19

Análise estatística

As distribuições dos vários parâmetros medidos foram examinadas para normalidade usando o teste de Kolmogorov Smirnov. Os resultados são apresentados como médias, medianas e desvios padrão (DPs), juntamente com as médias e intervalos de 95% obtidos após transformação dos dados, se apropriado. As inter-relações entre os vários conjuntos de dados foram examinadas por correlação, regressão em uma matriz de correlação e por análise fatorial e, para estas, as variâncias foram transformadas, geralmente em logaritmos, para atingir normalidade ou quase normalidade, quando apropriado. As análises fatoriais foram realizadas na tentativa de extrair um número relativamente pequeno de fatores ou construções subjacentes que simplificassem as inter-relações das variáveis e assim facilitar a compreensão dos processos complexos.

Resultados

Existiam 2154 homens na coorte na época dos exames da fase III (1989-1993). Amostras de sangue em jejum foram obtidas de 1800 destes, representando 84% do total da coorte.

Meios, medianas e SDs para as enzimas antioxidantes estudadas na coorte de Caerphilly dos homens são mostrados na Tabela 1. Somente SOD e GPX foram encontrados para serem distribuídos normalmente. Os resultados são apresentados para todas as enzimas como dados brutos e também após a transformação em log. As inter-relações (mostradas como coeficientes de correlação), entre as várias enzimas antioxidantes na coorte, são mostradas na Tabela 2. Foram observadas correlações significativas entre várias medidas, particularmente aquelas que estão ligadas através do estado inflamatório, ou seja, alfa-1-antiquimotripsina e caeruloplasmina (proteína e oxidase). As associações dos níveis de enzimas sanguíneas também foram comparadas com uma série de variações, especificamente: idade, hábito de fumar, classe social, índice de massa corporal e consumo de álcool. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Os dados foram examinados como dados brutos e padronizados para permitir possíveis efeitos de confundidores. Não houve grandes diferenças entre os dois. Portanto, apenas os dados padronizados são apresentados. Associações significativas foram observadas para: idade com alfa-1-anticimotripsina e com caeruloplasmina, tanto protéica quanto oxidase; hábito tabagista com alfa-1-anticimotripsina, com caeruloplasmina (proteína e oxidase) e com GPX; classe social com alfa-1-anticimotripsina, com caeruloplasmina (proteína e oxidase) e com GPX; índice de massa corporal com alfa-1-anticimotripsina e com proteína de caeruloplasmina. Não foi observada associação significativa entre o consumo de álcool e qualquer uma das enzimas sanguíneas medidas.

Quando a análise fatorial foi aplicada às sete variáveis plasmáticas (n=1689), dois fatores comuns foram derivados com valores eigenais de 2,24 e 1,40, que juntos explicaram 52,1% da variação total do conjunto de dados. O fator 1 explicou 32,0% da variação total do conjunto de dados. Foi mais estreitamente associado com alfa-1-antiquimotripsina, proteína de caeruloplasmina e oxidase (e em grau menos importante com SOD e catalase). O fator 2 explicou mais 20,1% da variação total. Foi mais estreitamente associado à SOD, catalase, G-6-PDH e GPX.

As medidas de adequação do modelo foram adequadas, com a notável exceção das comunalidades baixas de três das variáveis (0,42 para SOD, 0,34 para G-6-PDH, 0,18 para GPX) o que tornou o modelo inaceitável.

Também foi construído um modelo com três fatores. Embora o terceiro fator explique um pouco menos da variação total do conjunto de dados do que uma variável individual, as comunidades das variáveis (e outras medidas de adequação do modelo) melhoram, indicando que este modelo fornece uma descrição mais adequada das inter-relações entre as variáveis observadas. O Fator 3 explica mais 13,8% da variação total do conjunto de dados, dando um total para o modelo de três fatores de 65,9%. O fator 1 ainda está mais estreitamente associado à alfa-1-anticimotripsina, proteína de caeruloplasmina e oxidase. O fator 2 está mais intimamente associado à SOD e à catalase (e, em muito menor grau, à G-6-PDH). O fator 3 está mais intimamente associado com GPX e G-6-PDH.

A melhoria mais marcante na adequação do modelo de três fatores ao invés do modelo de dois fatores é a melhoria na comunalidade da GPX (de 0,18 para 0,78). As comunalidades de SOD e G-6-PDH também melhoraram (de 0,63 e 0,42). Parece que a GPX tem um papel particular que não está contida no modelo de três fatores.

Discussão

A coorte Caerphilly de homens tem sido extensivamente estudada desde o início do projeto em 1979.25-29 Um dos pontos fortes dos dados atuais é que eles foram derivados de uma amostra representativa da população. Caerphilly, no sul do País de Gales, é uma área industrial/residencial típica, embora a distribuição de classe social sugira que pode haver algum viés para as ocupações manuais. O objetivo do presente estudo foi obter estatísticas descritivas e examinar possíveis inter-relações entre as atividades das enzimas antioxidantes sanguíneas, utilizando a análise fatorial como técnica de redução de dados e criação de hipóteses. Além disso, foram investigadas as possíveis relações entre as enzimas antioxidantes e uma série de variações no estilo de vida. Embora atualmente não existam faixas de referência definitivas para as enzimas antioxidantes SOD, GPX e catalase, os resultados foram inicialmente comparados com dados publicados anteriormente, antes de possíveis relações entre as enzimas antioxidantes e os fatores do estilo de vida serem explorados.

A atividade de SOD é quantificada indiretamente em uma amostra pela capacidade dessa amostra em reduzir o fluxo de radicais livres detectado. As atividades de SOD variam entre os sistemas de ensaio e, portanto, os fabricantes de kits não recomendam faixas de referência. Entretanto, os dados obtidos na amostra Caerphilly são comparáveis com resultados publicados anteriormente usando o mesmo kit analítico.30 As atividades do GPX também podem variar dentro e entre sistemas de ensaio. Pensa-se que a GPX oxidada é susceptível à desactivação por cianeto, que está contida no reagente Drabkins utilizado para estabilizar a hemoglobina nas amostras e prevenir a ocorrência de outras reacções enzimáticas.31 Este problema foi ultrapassado pela adição de ditiotreitol/dithionite no tampão de diluição. Os resultados da coorte de Caerphilly (38,0±11,0 UI/g Hb) são semelhantes a um estudo recentemente publicado (36,1±6,5 UI/g Hb).32 Este último estudo, entretanto, foi baseado em um número muito pequeno (n=10) de pacientes com infarto do miocárdio. As atividades catalásticas médias na coorte de Caerphilly foram comparáveis com um estudo anterior, embora muito menor30 de nosso laboratório, de um grupo de homens de 50-54 anos (52,9±17,1 cf. 49,0±20 K/g Hb respectivamente, n=18), que por sua vez tiveram atividades catalásticas mais elevadas do que um estudo muito anterior (de 31.3±9,6 K/g Hb).33 O fabricante do kit G-6-PDH utilizou um valor `normal’ de 1,31±0,13 (média±SD) U/gHb que é comparável aos resultados obtidos neste estudo de 1,32±0,7 U/g Hb.

As proteínas de fase aguda são marcadores de doença. As medidas neste estudo são conhecidas como proteínas de fase aguda positivas (ou seja, aumentam nos estados da doença). Ambos os níveis médios de alfa-1-antiquimotripsina e caeruloplasmina (proteína) estão dentro de faixas de referência previamente estabelecidas34 de 0,3-0,6 e 0,15-0,6 g/l, respectivamente. Também foram observadas como sendo comparáveis às de uma coorte do braço britânico do estudo EPIC,35 enquanto as atividades de caeruloplasmina oxidase foram semelhantes às de uma investigação de 1994.36 A Tabela 3 mostra que, no conjunto, as enzimas antioxidantes sanguíneas mudaram pouco com a idade. Como esperado, as proteínas de fase aguda (uma medida do estado inflamatório) foram positivamente associadas à idade. Ambas as proteínas de fase aguda apresentaram associações positivas significativas com o hábito de fumar. Apenas a GPX demonstrou uma associação significativa (negativa) com o hábito de fumar. A atividade da GPX eritrócita mostrou-se anteriormente menor nos fumantes do que nos não-fumantes,37 provavelmente refletindo o aumento do estresse oxidativo que se pensava ocorrer neste grupo, devido aos radicais livres presentes na fumaça.38 Os resultados para a classe social mostraram uma tendência ao aumento do status inflamatório (a julgar pelo aumento dos níveis de proteínas de fase aguda), com a diminuição da classe social. A GPX foi a única enzima a mostrar uma associação significativa com a classe social, com atividades diminuindo no grupo manual. O IMC apresentou um padrão semelhante aos outros fatores do estilo de vida examinados, no entanto, as associações não foram tão fortes. As tendências e associações observadas para as classes sociais mais baixas não foram inesperadas, com circunstâncias ambientais e fatores do estilo de vida como tabagismo, dieta, etc. provavelmente contribuindo para maiores níveis de inflamação e aumento do IMC.

Análise dos fatores dos dados produziu um modelo com três fatores que explicou 65,9% da variação do conjunto de dados. Diversos aspectos interessantes foram revelados pela análise fatorial. O fator 1 do modelo reúne três medidas que estão ligadas através de mecanismos inflamatórios. O fator 2 inclui dois antioxidantes “principais”, a SOD e a catalase. A observação de que o fator 3 está mais intimamente associado com GPX e G-6-PDH é o que seria previsto pela teoria, já que esta última enzima produz cofactores reduzidos para a redução do glutatião que, por sua vez, pode ser utilizado pela primeira enzima. Evidências indicam que o glucose-6-fosfato é uma molécula central no metabolismo da glicose celular que influencia criticamente a atividade do ciclo do fosfato pentose e, via geração de NADPH, regula a atividade do GPX para desintoxicação radical e também a síntese de colesterol e triglicerídeos.39

A enzima Cu Zn SOD converte O2– em H2O2. O eritrócito GPX pode remover H2O2 a uma taxa elevada, e oxida o GSH para GSSG. O GSSG pode ser reduzido para GSH pelo NADPH produzido a partir de G-6-PD. A catalase tem uma capacidade maior que a GPX para destruir o H2O2 (produzido, entre outros, pela explosão respiratória dos neutrófilos), decompondo-o directamente em H2O; em termos de moléculas de H2O2 destruídas por minuto por molécula de enzima, é uma das enzimas mais activas conhecidas. No entanto, a sua afinidade com H2O2 também é baixa, e requer altas concentrações de H2O2 para alta actividade, lidando apenas lentamente com H2O2 em baixas concentrações.

A molécula de H2O2 tem a capacidade de atravessar rapidamente as membranas celulares e, se produzida extracelularmente, pode difundir-se para a célula mais próxima (incluindo os eritrócitos) para o metabolismo pelas enzimas antioxidantes. Portanto, os eritrócitos e outros tipos de células, podem agir como `sinks’ para H2O2. Esta interligação de mecanismos de defesa antioxidantes combinados com índices de inflamação (ou stress oxidativo) pode ser o que está a ser retratado no modelo de três factores. Isto apoia o conceito de um sistema de defesa antioxidante equilibrado e cooperativo no sangue, que depende dos níveis óptimos de vários sistemas antioxidantes e não da concentração ou actividade de um único antioxidante, mas não exclui ou diminui a importância de antioxidantes particulares, em situações ou condições particulares.

Em conclusão, os principais resultados deste estudo são que a caeruloplasmina (total e oxidase) está aumentada nos fumadores apenas nas classes sociais mais baixas. As mudanças na caeruloplasmina se refletiram em mudanças na fase aguda da reação alfa-1-antiquimiotripsina, e foram provavelmente relacionadas à inflamação ou estado da doença. A GPX foi a única enzima antioxidante a mudar significativamente com o estilo de vida, aumentando com a idade, mas foi menor nos fumantes e nas classes sócio-econômicas mais baixas e com IMC mais baixo. Em conjunto, estes resultados indicam uma diminuição da protecção antioxidante paralela ao stress oxidativo/inflamatório. A análise fatorial resultou em um modelo com três fatores explicando 65,9% da variação no conjunto de dados, o que parece indicar uma estreita inter-relação entre as enzimas antioxidantes.