Fosforilação Regula o CAP1 (Proteína Associada ao Ciclo 1) Funções na Motilidade e Invasão das Células de Câncer Pancreático

Elevated S308/S310 phosphorylation on CAP1, mas não up-regulated CAP1 expression, foi detectado em células de câncer pancreático. (A) A mancha ocidental revela níveis de expressão abundantes de CAP1 comparáveis aos das células de HeLa que foram detectadas em todas as quatro linhas de células cancerosas, e as células de controle do pâncreas (hTERT-HPNE) têm um nível de expressão CAP1 semelhante. Os resultados da mancha CAP2 mostram que as células cancerígenas PANC-1 e Mia PaCa-2 expressam níveis abundantes de CAP2 que foram notavelmente superiores aos das células de controle hTERT-HPNE. (B) A mancha ocidental revela fosforilação elevada de S308/S310 em CAP1 nas células PANC-1 e CFPAC-1 do pâncreas, em comparação com a das células não transferidas hTERT-HPNE do pâncreas. O anticorpo específico do fósforo reconhece sinais de fósforo em ambos os resíduos. As sequências alinhadas no topo mostram as sequências que envolvem o local regulador de fósforo tandem. Os resíduos serenos (S307 & S309 no rato CAP1; S308 & S310 no rato CAP1 humano) no sítio tandem são realçados em negrito e itálico (também sublinhado). Os sinais de fósforo foram quantificados usando densitometria, e os resultados de três experimentos foram analisados no teste t de Student e plotados no gráfico onde barras de erro representam S.E.M. “*” indica P < 0.05 e “**” indica P < 0.01. (C) Tratamento de células com inibidor GSK3 6-BIO durante 16 horas fosforilação CAP1 notavelmente reduzida tanto nas células de câncer pancreático PANC-1 quanto nas células hTERT-HPNE, de forma dose-dependente. 6-BIO também reduziu a fosforilação CAP1 em células CFPAC-1 de forma semelhante (não mostrado). GAPDH serve como controle de carga em Western blotting.

Nós relatamos anteriormente que GSK3 fosforilatos S309 no rato CAP124 (equivalente a S310 no rato CAP1 humano; sequências alinhadas mostradas na Fig. 1B). Dada a hiper-ativação relatada de GSK3 no câncer pancreático25, nós examinamos a potencial elevação da fosforilação de S308/S310 no CAP1 em células cancerosas, usando um anticorpo específico de fósforo que reconhece sinais de fósforo em ambos os resíduos serenos na mancha ocidental24. Curiosamente, a fosforilação S308/310 foi significativamente elevada nas células cancerígenas em comparação com a das células controle (Fig. 1B, mostrada com dados quantificados apenas para as linhas de células PANC-1 e CFPAC-1, mas resultados semelhantes foram obtidos com células AsPC-1 e Mia PaCa-2). Em seguida, inibimos o GSK3 ao tratar células cancerosas com um potente inibidor de GSK3 6-BIO (6-bromoindirubina-3′-oxime)31 e constatamos que o tratamento reduziu a fosforilação de S308/S310 em células CAP1 do PANC-1 e CFPAC-1, de forma dose-dependente (Fig. 1C, mostrada apenas para células PANC-1). O tratamento com 6-BIO também reduziu a fosforilação do CAP1 nas células do pâncreas de controle. Consistentemente, um inibidor mais seletivo de GSK3, LiCl32, também reduziu a fosforilação CAP1 nas células PANC-1 e AsPC-1, como mostrado mais adiante. Estes resultados apoiam que o GSK3 também faz parte do mecanismo de fosforilação para CAP1 em S308/S310 em células de câncer pancreático. Também se observa que o tratamento das células cancerígenas e células de controle com 6-BIO levou consistentemente a um aumento notável da regulação do CAP1, através de um mecanismo desconhecido.

Knockdown do CAP1 levou ao aumento das fibras de estresse, bem como à redução da motilidade e invasão das células cancerígenas

A seguir tentamos silenciar o CAP1 para determinar os papéis do CAP1 nas células cancerígenas do pâncreas. O paradigma de knockdown estável que desenvolvemos anteriormente é compatível com uma estratégia de resgate, que permite a verificação da especificidade dos fenótipos derivados do esgotamento do CAP112,18,24. Utilizando dois shRNA constrói S2 e S3 que visam sequências nucleotídicas independentes e silenciam eficazmente o CAP1 nas células de HeLa e de cancro da mama12,18,24,33, fomos capazes de gerar clones estáveis com eficiente derrubamento CAP1 nas células PANC-1 e AsPC-1, como confirmado no Western blotting (Fig. 2A). Dois clones estáveis derivados de PANC-1 (S2-1 e S3-3) e AsPC-1 (S2-3 e S2-7) foram estabelecidos, respectivamente, através da seleção de Neomicina. Notavelmente, as tentativas de silenciar o CAP1 nas linhas de células cancerosas CFPAC-1 e Mia PaCa-2, no entanto, não foram bem sucedidas. As células CFPAC-1 não conseguiram formar colônias após a seleção antibiótica, enquanto nenhuma das aproximadamente duas dúzias de colônias estáveis rastreadas teve redução substancial da expressão CAP1 em células Mia PaCa-2 (dados não mostrados).

Knockdown de CAP1 em células cancerígenas levou ao aumento das fibras de estresse actínico, e reduziu a motilidade e invasão celular. (A) Derrubamento eficiente do CAP1 em dois clones estáveis, cada um para células PANC-1 e AsPC-1, como confirmado na mancha ocidental. O CAP1 foi detectado em Western blotting, onde o GAPDH foi usado como controle de carga. (B) O esgotamento do CAP1 nas células PANC-1 levou ao aumento das fibras de tensão actínica. Nas células de controle que abrigam o vetor vazio para o shRNA (Vec), havia fibras de tensão de actina muito limitadas (indicadas com setas). Em contraste, nas células CAP1-knockdown (S2-1 e S3-3), as fibras de actina tensa foram realçadas (indicadas com setas) como observado em microscopia fluorescente após a coloração com Falloidina. (C) Esgotamento do CAP1 reduziu a motilidade nas células PANC-1 e AsPC-1, conforme detectado nos ensaios de cicatrização de feridas e migração Transwell (apenas para PANC-1). Para os ensaios de migração Transwell, foram carregadas ~2 × 104 células com soro sedento durante a noite em cada inserção colocada num poço com meio contendo soro. Após 16 horas, as células migradas foram pontuadas e os dados de três experimentos independentes foram coletados, analisados usando o teste t de Student, e plotados no gráfico onde as barras de erro representam S.E.M. “*” indica P < 0.05 em comparação com o das células de controle que abrigam um vetor vazio (Vec). (D) Esgotamento do CAP1 invasão Matrigel reduzida em células PANC-1. Os ensaios, coleta de dados e análises foram realizados de forma semelhante aos ensaios de migração Transwell, exceto que as membranas de inserção foram pré-revestidas com Matrigel. O “*” indica P < 0,05 em comparação com o das células de controle. (E) Redução do EMT nas células PANC-1 de choque CAP1, como indicado pelo aumento da expressão E-Cadherin, bem como redução dos níveis de expressão Vimentin nos clones estáveis de choque CAP1. GAPDH serve como um controle de carga nas florescências ocidentais.

Examinamos primeiro as alterações morfológicas e citoesqueléticas de actina nas células CAP1-knockdown PANC-1 e AsPC-1. Ao contrário do aumento no tamanho das células CAP1-knockdown HeLa e células metastáticas do câncer de mama12,18,24, o esgotamento do CAP1 não causou aumento notável no tamanho das células PANC-1 ou AsPC-1. Em seguida, coramos o citoesqueleto de actina nas células PANC-1 com Falloidina, seguido de microscopia fluorescente. As células PANC-1 (e células de câncer pancreático em geral) parecem ter estruturas de citoesqueleto de actina mal organizadas, especialmente em termos das fibras de estresse (Fig. 2B), em relação às linhas celulares comumente utilizadas para estudos de citoesqueleto de actina, como os fibroblastos HeLa e NIH3T312,24. Entretanto, o aumento das fibras de estresse ficou evidente nas células CAP1-knockdown PANC-1 em comparação com as células de controle (Fig. 2B). Todas as 26 células de controle que abrigam um vetor vazio examinado mostraram presença muito limitada de fibras de estresse. Em contraste, 20 de 27 (74,1%) de S2-1 e 18 de 23 (78,3%) de células S3-3 CAP1-knockdown examinadas tinham fibras de estresse notavelmente enahncedidas, semelhante ao mostrado na Fig. 2B. A acumulação de fibras de estresse tem sido consistentemente observada em outras células com depleção CAP112,13, um fenótipo que se acredita ter derivado da perda de ambas as funções CAP1 no seqüestro de monômeros de actina e na promoção de rotação de filamentos de actina.

Consistente com o aumento das fibras de estresse, a depleção do CAP1 tem sido relatada para reduzir a motilidade em vários tipos de células de mamíferos, incluindo células cancerígenas13,14,17,18,19. Também foi constatado que a destruição transitória do CAP1 em células cancerosas do pâncreas reduziu a motilidade celular em ensaios de cicatrização de feridas14. Testamos o efeito da derrubada estável do CAP1 sobre a invasividade das células cancerosas do pâncreas, conduzindo ensaios de cicatrização de feridas, ensaios de migração da Transwell, bem como ensaios de invasão de Matrigel. O esgotamento do CAP1 reduziu substancialmente a mobilidade celular nos ensaios de cicatrização de feridas tanto para células PANC-1 como para células AsPC-1 (Fig. 2C), o que é consistente com os resultados anteriormente relatados14. As feridas nas células CAP1-knockdown PANC-1 (tanto S3-3 como S2-1) cicatrizaram apenas marginalmente 24 horas após a introdução, enquanto que nas células de controlo a lacuna tinha sido quase completamente preenchida. Efeitos semelhantes foram observados nos clones estáveis CAP1-knockdown AsPC-1 clones S2-3 e S2-7 (Fig. 2C). Os resultados dos ensaios de migração Transwell das células PANC-1 foram consistentes com os dos ensaios de cicatrização de feridas, como mostrado no gráfico de resultados quantificados no painel inferior (Fig. 2C). Além disso, os ensaios de invasão revelam que o esgotamento do CAP1 também reduziu a capacidade das células cancerosas PANC-1 para penetrar e invadir através do Matrigel (Fig. 2D). As análises do teste t de Student dos dados recolhidos em três ensaios independentes revelam uma invasão significativamente reduzida nas células estáveis do PANC-1 (Fig. 2D). Finalmente, como o EMT (Transição Epitelial-Mesenchimal) está relacionado com a invasividade das células cancerosas, testamos o efeito potencial do choque CAP1 sobre o EMT. De fato, as células CAP1-knockdown PANC-1 tinham a E-Cadherina aumentada, o que indica um EMT reduzido (Fig. 2E). Também testamos outro marcador EMT, Vimentin, e descobrimos que o esgotamento do CAP1 reduziu sua expressão (Fig. 2E). Juntos, estes resultados apoiam um papel necessário do CAP1 na invasividade e do EMT nas células cancerosas PANC-1.

Inibição do GSK3, que suprime a fosforilação do CAP1, redução da motilidade e invasão das células cancerosas

Nossos achados anteriores sugerem que a fosforilação transitória é crucial para a função do CAP1 na regulação do citoesqueleto actínico24. A elevada fosforilação CAP1 nas células cancerosas pancreáticas, consistente com o GSK3 ativado, sugere que a regulação do fósforo também pode desempenhar um papel para a função CAP1 na invasividade das células cancerosas. Testamos esta possibilidade inibindo o GSK3, que suprime a fosforilação S308/S310 e, entretanto, interrompe a regulação do CAP1 através da fosforilação transitória no local de regulação. As células PANC-1 foram tratadas com 6-BIO seguidas por ensaios de migração e invasão celular. Os efeitos da fosforilação reduzida S308/S310 sobre o CAP1, através de tratamento com 5 μM 6-BIO (Fig. 1C), foram testados primeiro. Como demonstrado na Fig. 3A, o tratamento 6-BIO reduziu significativamente a motilidade das células PANC-1, tanto nos ensaios de cicatrização de feridas como nos ensaios de migração Transwell. Também confirmámos que o tratamento das células PANC-1 e AsPC-1 com outro inibidor GSK3, LiCl, reduziu a fosforilação CAP1, bem como a motilidade celular nos ensaios de cicatrização de feridas (Fig. 3A,B). Além disso, o tratamento 6-BIO também reduziu a invasão Matrigel de células PANC-1 (Fig. 3C). Finalmente, uma vez que o GSK3 é conhecido por regular uma ampla gama de funções celulares através de uma infinidade de moléculas do substrato, o efeito da inibição do GSK3 na motilidade celular é provavelmente um resultado coletivo através de múltiplos alvos de GSK3 que estão envolvidos na regulação do citoesqueleto, polarização celular e migração34,35. Assim, testamos e comparamos os efeitos do 6-BIO na redução da motilidade celular nas células CAP1-knockdown PANC-1 e células de controle. Como mostrado no gráfico da Fig. 3D, o tratamento 6-BIO reduziu significativamente a motilidade das células controle (Vec), mas não a das células CAP1-knockdown (S2-1 e S3-3) nos ensaios de cicatrização da ferida. Em conjunto, estes resultados apoiam que a regulação do fósforo através do S308/S310 desempenha um papel importante no CAP1 para promover a motilidade e invasão nas células cancerosas do pâncreas.

Inibição do GSK3, que reduziu a fosforilação CAP1, também comprometeu a motilidade e invasão das células cancerosas. (A) Tratamento de células PANC-1 com 6-BIO ou LiCl de motilidade celular reduzida na cicatrização de feridas e ensaios de migração Transwell. O tratamento com 100 mM de LiCl reduziu eficazmente a fosforilação CAP1 também nas células PANC-1. Os ensaios de migração Transwell com células PANC-1 foram conduzidos de forma semelhante como descrito na Fig. 2 onde a TN indica células sem tratamento 6-BIO. (B) O tratamento com 100 mM LiCl também reduziu notavelmente a fosforilação CAP1 em células AsPC-1, assim como a motilidade celular nos ensaios de cicatrização de feridas. (C) Tratamento de células PANC-1 com 5 μM 6-BIO reduziu significativamente a invasão de células cancerígenas nos ensaios de invasão Matrigel. Os ensaios de invasão de Matrigel, incluindo a recolha de dados e análises, foram conduzidos de forma semelhante, tal como descrito na Fig. 2D. (D) A destruição do CAP1 em células PANC-1 comprometeu o efeito do 6-BIO na redução da motilidade celular nos ensaios de cicatrização de feridas. Os clones PANC-1 estáveis de controlo e CAP1-knockdown foram cultivados durante 16 horas após a introdução da ferida, e as linhas tracejadas indicam as margens da fenda inicial. A motilidade celular foi quantificada, analisada usando o teste t de Student e plotada no gráfico onde as barras de erro representam o desvio padrão. “*” indica P < 0,05 e “**” indica P < 0,01.

Os mutantes de fósforo do CAP1 tinham funções comprometidas para aliviar o aumento das fibras de tensão e promover o desenvolvimento da lamelipodia nas células CAP1-knockdown PANC-1

Os nossos achados das células CAP1-knockdown suportam que o CAP1 é necessário para a motilidade e invasão das células cancerígenas, e os resultados da inibição do GSK3 sugerem que a fosforilação S308/S310 desempenha um papel fundamental nas funções do CAP1. Em seguida, empregamos uma estratégia de reexpressão para estabelecer ainda mais estes casos. Os mutantes do tipo selvagem CAP1 (WTCAP1) e os mutantes fosforados que imitam as formas fosforiladas (S307D/S309D; DD) ou não fosforilatáveis (S307A/S309A; AA) do CAP1, como descrito anteriormente12,18,24, foram re-expressos de forma estável nas células CAP1-knockdown PANC-1 para testar suas capacidades de resgatar os fenótipos citoesqueléticos e morfológicos celulares. Estes mutantes abrigam desajustes na sequência de alvo S3 do shRNA para evitar o reconhecimento dos mRNAs derivados pelo shRNA estavelmente presente nas células knockdown, mas sem alterar qualquer aminoácido no CAP112. Conseguimos estabelecer clones estáveis que reexpressam o rato WT CAP1, ou o fósforo AA e DD mutante, como confirmado no western blotting contra o 6xHis tag (Fig. 4A). Note que duas faixas irrelevantes foram removidas da imagem original do Western blot (amostras nessas duas faixas foram usadas para confirmar a reexpressão de dois mutantes serenos de fósforo 36 no N-terminus). O conjunto completo do resultado original do Western blot é mostrado na Fig. 1 Suplementar. A morfologia das células reexpressoras do mutante AA (AA-R) ou DD (DD-R) foi examinada em microscopia de fase, e comparada com a das células reexpressoras do WTCAP1 (WT-R). Foi relatado que a derrubada do CAP1 em alguns tipos de células de mamíferos, incluindo HeLa e células metastáticas do câncer de mama, levou a um aumento significativo do tamanho celular12,13,18, um fenótipo que anteriormente confirmamos ser específico para a derrubada do CAP112,18. O CAP1-knockdown em células PANC-1 ou células AsPC-1, entretanto, não mostrou esse efeito. Pelo contrário, a re-expressão estável do WTCAP1 ou dos mutantes de fósforo nas células knockdown aumentou significativamente o tamanho das células (Fig. 4B). Além disso, a reexpressão do WTCAP1 levou ao desenvolvimento de uma lamelipodia de tamanho robusto (indicada com setas), uma estrutura subcelular que é rica em actina filamentosa e é crítica para o movimento celular direccional (Fig. 4C), enquanto que praticamente nenhuma das células knockdown que abrigam um vector de controlo vazio desenvolveu qualquer lamelipodia deste tipo. AA ou DD mutante reexpressos também estimularam a formação de lamelipódios até certo ponto, mas seus tamanhos foram visivelmente menores em comparação com os das células reexpressoras do WTCAP1 (indicado com setas na Fig. 4C). Contamos 200 células para cada tipo de célula, e as percentagens de células que abrigam lamelipódios de tamanho grande foram: 0% (0/200) para as células knockdown (Vec), 14,5% (29/200) para as células WT-R, e 9% (18/200) e 7,5% (15/200), respectivamente, para as células AA-R e DD-R.

Figure 4

Efeitos da reexpressão do WTCAP1 e dos mutantes do fósforo nas células CAP1-knockdown PANC-1 sobre o citoesqueleto de actina, tamanho celular e desenvolvimento de lamelipódios. (A) Confirmação da reexpressão do WTCAP1 e dos mutantes de fósforo AA e DD nas células estáveis S3-3 CAP1-knockdown PANC-1 em Western blotting usando o anticorpo contra o tag 6xHis. Duas faixas irrelevantes foram removidas da imagem original do Western blotting (mostrada na Fig. 1 do Suplemento); (B) dados quantificados mostrando o aumento significativo do tamanho das células nas células reexprimindo o WTCAP1 ou os mutantes fosforosos nas células do CAP1-knockdown. Os tamanhos de 50 células por campo foram medidos usando o programa Image-J. Os dados foram analisados usando o teste t de Student, e plotados no gráfico onde as barras de erro indicam o desvio padrão. O “*” indica P < 0,05 em relação às células de controle que abrigam o vetor vazio (Vec-R). (C) As imagens de fase mostram que a reexpressão do WTCAP1 ou dos mutantes do fósforo estimulou a formação de lamelipódios. Algumas das células reexpressoras do WTCAP1 (WT-R) desenvolveram lamelipódios de tamanho extremamente grande (indicados com setas). A reexpressão do mutante AA (AA-R) ou DD (DD-R) também simulou a formação de lamelipódios, mas seus tamanhos são visivelmente menores em relação aos das células que reexpressam o WTCAP1. Não se observaram tais lamelipódios nas células de controle CAP1-knockdown que abrigam o vetor vazio (Vec-R). (D) A reexpressão do WTCAP1 nas células CAP1-knockdown PANC-1 reduziu as fibras de tensão, enquanto que as células que reexpressavam os mutantes tinham fibras de tensão melhoradas. As células que reexprimem o fósforo mimético DD mutante tiveram as fibras de tensão mais realçadas. As setas indicam as fibras de tensão, ou falta delas no caso das células WT-R.

Em seguida, examinamos as capacidades dos mutantes fosforosos em aliviar as fibras de tensão melhoradas nas células CAP1-knockdown PANC-1. Como mostrado nas imagens confocais na Fig. 4D, a reexpressão do WTCAP1 (WT-R) aliviou efetivamente as fibras de tensão melhoradas, assim resgatando o fenótipo, e as fibras de tensão foram dissolvidas em grandes áreas indicadas com uma seta. Em contraste, os mutantes de fósforo foram menos efetivos em aliviar as fibras de tensão realçadas. As células reexprimindo o mutante AA tinham fibras de tensão modestamente melhoradas do que as células resgatadas pelo WTCAP1, enquanto as células reexprimindo o mutante DD pareciam ter ainda mais fibras de tensão melhoradas. Estes resultados são consistentes com nossas descobertas anteriores das células de HeLa que sugerem que o CAP1 desfosforado é a forma ‘ativa’ em relação ao CAP124 fosforado, enquanto que acredita-se que a fosforilação transitória seja necessária para as funções celulares ótimas do CAP1. Estes resultados também sugerem que a fosforilação transitória S308/S310 é importante para o CAP1 regular o citoesqueleto de actina nas células cancerosas do pâncreas; interromper a regulação através da fosforilação transitória leva a defeitos na função do CAP1 na promoção da rotação do filamento de actina.

Mutantes de fósforo CAP1 tiveram defeitos que resgataram a reduzida invasividade nas células cancerosas CAP1-knockdown

Desde que a rotação dinâmica do filamento de actina é a principal força motriz do movimento celular, testamos em seguida como os mutantes de fósforo resgatam a reduzida motilidade celular e invasão nas células CAP1-knockdown PANC-1. Primeiro realizamos ensaios de migração Transwell, e descobrimos que a reexpressão do WTCAP1 aumentou significativamente a motilidade celular em comparação com as células de controle que abrigam um vetor vazio, como mostrado em resultados quantificados no gráfico (Fig. 5A). O AA mutante reexpresso (AA-R), embora não tão eficaz como o WTCAP1, resgatou parcialmente a reduzida motilidade celular nos ensaios de migração da Transwell. Em contraste, o DD mutante (DD-R) não conseguiu resgatar a reduzida motilidade celular, e a taxa foi comparável à das células CAP1-knockdown que abrigam um vetor vazio. Estes resultados são consistentes com a capacidade de resgatar as fibras de tensão melhoradas pelo WTCAP1 e os mutantes de fósforo. Testamos ainda o resgate da invasão reduzida da Matrigel nas células CAP1-knockdown, como mostrado nos resultados quantificados na Fig. 5B. Similarmente, o WTCAP1 resgatou a invasão reduzida nas células CAP1-knockdown PANC-1 de forma mais eficaz; o mutante AA obteve um resgate parcial enquanto o mutante DD falhou literalmente em resgatar o fenótipo. Finalmente, a reexpressão do WTCAP1 nas células CAP1-knockdown também reduziu a expressão de E-Cadherin (Fig. 5C), apoiando ainda mais que o CAP1 é necessário para o EMT nas células cancerosas PANC-1. Juntos, estes resultados apoiam que a regulação do fósforo através do sítio tandem S308/S310 desempenha um papel importante no CAP1 para promover a motilidade e a invasão das células cancerosas do pâncreas.

Efeitos do WTCAP1 e dos mutantes do fósforo no resgate da reduzida motilidade e invasão das células CAP1-knockdown PANC-1. (A) O WTCAP1 e o mutante AA resgataram efetivamente a reduzida motilidade nas células CAP1-knockdown PANC-1 nos ensaios de migração Transwell, enquanto o mutante DD falhou ao fazê-lo. Os experimentos, coleta de dados e análises foram conduzidos de forma similar ao descrito na Fig. 2. As barras de erro representam S.E.M., e “*” indica P < 0.05 em comparação com as células de controle que abrigam um vetor vazio (Vec-R). (B) O WTCAP1 e o mutante AA resgataram efetivamente a invasão reduzida de Matrigel das células CAP1-knockdown PANC-1, enquanto o mutante DD também não o fez. Os experimentos, coleta de dados e análises foram conduzidos de forma similar ao descrito na Fig. 2. As barras de erro representam S.E.M., e “*” indica P < 0,05 em comparação com as células de controle. (C) A reexpressão do WTCAP1 também resgatou o E-Cadherin com regulação ascendente nas células CAP1-knockdown PANC-1.

Eficácia que suporta que o CAP1 mede os sinais do factor de crescimento extracelular para controlar a invasividade das células cancerosas

Estímulos fisiológicos, como os factores de crescimento PDGF e HGF (Hepatocyte Growth Factor)36, são conhecidos por estimular o rearranjo do citoesqueleto actin e a migração celular. Como a regulação do fósforo no S308/S310 é crucial para as funções CAP1 na regulação do citoesqueleto actínico e da invasividade das células cancerígenas, estudamos a possibilidade destes estímulos poderem regular a fosforilação CAP1, e através disto controlar o rearranjo do citoesqueleto actínico e a invasividade das células cancerígenas. Curiosamente, o tratamento das células PANC-1 e AsPC-1 com soro sedento com PDGF reduziu a fosforilação S308/S310 no CAP1, mais notavelmente no tempo de 5 minutos (Fig. 6A,B). O tratamento das células de câncer do pâncreas com HGF ou soro não teve um efeito considerável na indução da desfosforilação do CAP1 (Suplemento Fig. 2; mostrado para células PANC-1). Portanto, a sinalização através do CAP1 é provavelmente pelo menos parcialmente responsável pelo PDGF para estimular a reorganização do citoesqueleto actínico e a invasividade das células cancerígenas. Estes resultados também são consistentes com a noção de que o CAP1 desfosforado é a forma “ativa”, como sugerido por múltiplas linhas de evidência, incluindo a ligação de cofilina, a localização subcelular dos mutantes fosforados e a fosforilação elevada do CAP1 em células cultivadas em suspensão24. Entretanto, acredita-se que a fosforilação transitória no local regulatório tandem, ou seja, o ciclo entre as formas fosforilada e desfosforilada, seja necessária para as funções celulares ótimas do CAP124. A fosforilação do CAP1 sinaliza uma função provável em coorte com os sinais de fosforilação do CAP1, para regular as funções celulares do CAP1 através da fosforilação transitória em S308/S310.

PDGF desfosforilação induzida do CAP1 em células cancerosas do pâncreas. (A) Tratamento de células cancerígenas AsPC-1 com soro sedento de soro com desfosforilação induzida por PDGF de CAP1 em S308/S310. As células foram cultivadas de um dia para o outro, com soro sedento durante 24 horas, seguido de tratamento com 30 ng/ml de PDGF para as durações de tempo indicadas. Os lisados celulares foram preparados e utilizados na maturação ocidental com um anticorpo específico de fósforo que detecta sinais de fósforo em ambos os resíduos do local regulador do tandem no CAP1. O efeito da desfosforilação foi mais significativo nos 5 minutos de tratamento PDGF. (B) O tratamento das células de PANC-1 com soro sedento com PDGF também induziu uma notável desfosforilação do CAP1, de forma semelhante com as células AsPC-1. O tratamento das células e a blotting ocidental foram realizados seguindo os mesmos procedimentos utilizados para as células AsPC-1. GAPDH serviu como controle de carga no Western blot.

Depleção do CAP1 em células de câncer pancreático reduziu a atividade de FAK mas não causou alterações na ERK ou proliferação celular

Identificamos recentemente um novo papel para o CAP1 na regulação da proliferação de células de câncer de mama, onde a depleção do CAP1 exerce efeitos dependentes do contexto celular sobre a proliferação, acompanhados de alterações consistentes na atividade ERK18. Testamos se o CAP1 também pode regular a ERK e a proliferação de células cancerígenas do pâncreas. Não foram detectadas alterações significativas na expressão ou fosforilação da ERK nos clones estáveis do CAP1-knockdown PANC-1, em comparação com os clones das células de controle (Fig. 3A suplementar). Também realizamos ensaios de MTT testando a proliferação das células knockdown estáveis S2-1 e S3-3 e comparando-as com a das células controle (Vec), e detectamos taxas levemente diminuídas de proliferação celular nas células knockdown (Suplemento Fig. 3B). Entretanto, as diferenças foram estatisticamente insignificantes, com os valores de P comparando D.O. (a 570 nm) entre células S2-1 e células controle a 0,219, e entre células S3-3 e células controle a 0,223. Estes resultados indicam que o CAP1 não desempenha um papel significativo na regulação da proliferação nas células cancerosas do pâncreas. Além disso, dado que a tendência geral de que o paradigma de knockdown estável é propenso a variações de clone, geramos pools de células CAP1 estáveis de knockdown PANC-1, que se acredita refletirem mais precisamente os efeitos do esgotamento do CAP1 no ERK, evitando a potencial influência de um viés de seleção. Como mostrado na Fig. 7A, os pools de células estáveis PANC-1 com eficiente derrubamento CAP1, derivados das construções S2 e S3 de shRNA, foram estabelecidos após a seleção da Neomicina, como confirmado no Western blotting. Consistente com os achados do uso de clones estáveis de knockdown, nenhuma alteração notável na expressão ERK ou sua fosforilação foi detectada nas células da piscina knockdown em comparação com as células da piscina de controle.

CAP1-knockdown As células da piscina PANC-1 tiveram atividade FAK e aderência celular reduzidas, mas nenhuma alteração na ERK. (A) As células do pool PANC-1 CAP1-knockdown, derivadas das construções S2 e S3 shRNA, não mostraram expressão ou atividade ERK alterada em comparação com as células do pool de controle que abrigam um vetor vazio, como detectado no western blotting. A atividade ERK foi detectada em Western blotting usando um anticorpo específico de fósforo contra os locais Thr202/Tyr204. GAPDH serviu como controle de carga. (B) A atividade FAK reduzida foi detectada nas células da piscina CAP1-knockdown PANC-1, em comparação com as células da piscina de controle. A atividade FAK foi avaliada por fosforilação no Tyr397, usando um anticorpo específico de fósforo contra o local em Western blotting; (C) As células do pool CAP1-knockdown tiveram adesão celular reduzida nos pontos de tempo testados (45 minutos e 2 horas) após as células de revestimento em placas revestidas de fibronectina. Aproximadamente 2 × 104 células foram revestidas em cada poço de uma placa de 6 poços, e as células não ligadas nos pontos de tempo indicados foram lavadas. O número de células ligadas foi contado em cinco campos aleatórios sob um microscópio de fase e as imagens tiradas. (D) Os dados coletados em três ensaios independentes de adesão celular foram analisados usando o teste t de Student, e plotados no gráfico onde as barras de erro representam o desvio padrão. “**” Indica P < 0,01 em relação às células controle que abrigam o vetor vazio.

Knockdown do CAP1 em células de câncer de mama causou alterações distintas no FAK nas células de câncer de mama metastáticas e não metastáticas18. Detectámos também uma actividade FAK reduzida, sem alterações nos níveis de expressão FAK, nas células cancerígenas da piscina PANC-1 CAP1-knockdown (Fig. 7B). Com base nestes resultados, testamos ainda os efeitos do esgotamento do CAP1 sobre a adesão celular em ensaios de adesão, de forma semelhante ao que fizemos anteriormente12,18. Verificamos que as células CAP1-knockdown pools derivadas de ambas as construções de shRNA tiveram notável redução na adesão celular em comparação com as células de controle (Fig. 7C). Em ambos os momentos (45 minutos e 2 horas), após as células terem sido revestidas com fibronectina, foram fixadas significativamente mais células de controle do que as células da piscina de choque CAP1. Além disso, mais células de controle anexas também tinham se espalhado completamente (lamelipodia desenvolvida e células não se mostram tão brilhantes) em comparação com as células do pool CAP1-knockdown (Fig. 7C). Para a comparação, foram quantificados os números de células anexas de três campos, e os dados de três experimentos independentes foram quantificados como plotados no gráfico (Fig. 7D).