Integrin CD11b activation drives anti-tumor innate immunity

Integrin CD11b regulates macrophage polarization

Nós relatamos anteriormente que o receptor VCAM integrin α4β1 promove o recrutamento de células mielóides da medula óssea para o microambiente do tumor, estimulando assim a supressão imunológica, a angiogênese e a progressão tumoral2,13,14,15. Em contraste ao seu papel na regulação do recrutamento de células mielóides para os tecidos durante a inflamação aguda16,17,18, verificamos que o CD11b (αMβ2), um receptor de integrina de células mielóides para ICAM-1 e fibrinogênio, não afeta o recrutamento de células mielóides para tumores, já que a deleção global de CD11b em ratos de Itgam-/- não tem efeito no número de células mielóides em circulação ou no número de células recrutadas para tumores (Figura Complementar 1; Figura Complementar 2a-d). Surpreendentemente, porém, descobrimos que a integrina CD11b desempenha um papel essencial na regulação da polarização dos macrófagos. Os macrófagos Itgam-/- exibiram uma expressão melhorada de genes imunossupressores e proteínas e reduziram fortemente a expressão pro-inflamatória de genes e proteínas em comparação com os macrófagos WT, quer estimulados sob condições de estimulação basal, IL-4 ou IFNγ/LPS (Fig. 1a, Figura Complementar 2e-f). Para determinar se o CD11b também regula a polarização dos macrófagos in vivo, isolamos e caracterizamos F4/80 + TAMs a partir de tumores LLC cultivados em camundongos Itgam-/- e WT. Descobrimos que Itgam-/- TAMs também expressaram níveis significativamente maiores de mRNAs associados com supressão imunológica e angiogênese, como Arg1, Tgfb, Il10, Il6, e Pdgfb, e expressão significativamente menor de genes associados com estimulação imunológica, como Ifng, Nos2, e Tnfa do que TAMs WT (Fig. 1b, Figura Complementar 2g).

Importante e transitório derrubamento mediado pelo siRNA do CD11b em macrófagos cultivados in vitro expressão elevada do gene imunossupressor e diminuição da expressão do gene imunossupressor, efeitos comparáveis à deleção do CD11b (Fig. 1c), indicando que mesmo a perda transitória do CD11b controla a expressão do gene imunossupressor de macrófagos. Para tratar se a expressão ou função do CD11b controla a expressão do gene do macrófago, examinamos o efeito dos anticorpos inibitórios CD11b na expressão do mRNA do macrófago. O bloqueio da ligação mediada do CD11b do macrófago murino aos substratos revestidos com ICAM-1 por anticorpos neutralizantes anti-CD11b também induziu a expressão imunossupressora do mRNA em macrófagos (Fig. 1d). Similarmente, a adesão de macrófagos à integrina α4β1 substrato VCAM-1 ou perda de adesão por cultura em suspensão promoveu transcrição murina e imunossupressão humana, enquanto a adesão a superfícies revestidas com ICAM-1 promoveu transcrição imunossupressora (Fig. 1d). 1e, f, Figura suplementar 1h), indicando que a ligação do CD11b controla a transcrição de macrófagos estimuladores imunológicos.

A perda da expressão de citocinas pró-inflamatórias em Itgam-/- macrófagos sugeriu que o CD11b pode regular a ativação de fatores de transcrição pró-inflamatórios, tais como NFκB. Verificamos que os macrófagos Itgam-/- exibiram fosforilação serina 536 reduzida em NFκB (uma indicação de ativação reduzida19) em resposta à estimulação LPS comparada aos macrófagos WT, sugerindo que o CD11b tem um papel na ativação do NFκB (Fig. 1g). Como outros estudos têm implicado o CD11b na promoção de respostas pró-inflamatórias de monócitos e células dendríticas através de interações diretas do LPS com domínios extracelulares integrin beta220,21, nossos resultados indicam que a ativação e a sinalização do CD11b desempenham papéis-chave na regulação da polarização dos macrófagos in vitro e in vivo.

Macrofago CD11b regula o crescimento tumoral

Nossos dados indicam que os derivados de medula óssea Itgam-/- e macrófagos associados ao tumor apresentam perfis transcripcionais mais imunossupressores do que os macrófagos WT. Para determinar se essa diferença afeta o crescimento tumoral, nós transferimos adotivamente WT ou Itgam-/- medula óssea derivada ou macrófagos associados ao tumor com células tumorais para os ratos receptores WT ou Itgam-/-. Anteriormente, nós demonstramos que BMDM ou TAMs imunossupressores transferidos adotivamente podem estimular o crescimento tumoral9,10. Notavelmente, os macrófagos Itgam-/- derivados da medula óssea (Fig. 1h), bem como os macrófagos Itgam-/- derivados do tumor (Fig. 1i) estimulam o crescimento tumoral de forma potente em comparação com os macrófagos WT tanto em camundongos WT quanto em camundongos Itgam-/-. Como os macrófagos Itgam-/- apresentam um perfil imunossupressor transcripcional (Fig. 1b), e tumores derivados de ratos Itgam-/- apresentam um perfil imunossupressor transcripcional geral (Fig. 1j), esses dados sugerem que a expressão ou ativação do CD11b pode impactar o crescimento tumoral geral. De fato, descobrimos que tumores subcutâneos (LLC), ortotópicos (melanoma) e autóctones (PyMT) cresceram mais agressivamente em Itgam-/- do que em camundongos WT (Fig. 1k). Como os ratos Itgam-/- exibiram substancialmente mais CD4 + Foxp3 + Tregs e menos células CD8+ T em tumores do que os ratos WT (Figura Complementar 3a-b), nossos estudos apóiam a conclusão de que o CD11b desempenha um papel fundamental na regulação da resposta imunológica geral em tumores.

Estudos anteriores mostraram que a Isoleucina 332 na molécula CD11b serve como um interruptor alostárico controlando a ativação e a forma do receptor de adesão22. Para determinar se a ativação do CD11b controla o desenvolvimento tumoral, geramos uma linhagem de rato knockin CD11b ativada constitutivamente (C57BL/6 ITGAMI332G introduzindo uma mutação pontual I332G no gene murino Itgam. Ratos knockin I332G expressam níveis normais de CD11b da superfície celular tanto em monócitos quanto em granulócitos e exibem níveis normais de todos os níveis de células sanguíneas (Figura Suplementar 3c-d). Os ensaios de adesão in vitro com macrófagos derivados da medula óssea destes ratos mostraram que as células I332G expressam o CD11b constitutivamente activo (Figura 3e Suplementar). É importante notar que os ratos I332G Itgam knockin apresentaram uma redução significativa do crescimento do tumor LLC (Figura 1k). Assim, enquanto a deleção CD11b estimula a polarização dos macrófagos antiinflamatórios, inibe o recrutamento de células T CD8+ e promove o crescimento tumoral, a ativação do CD11b inibe potentemente o crescimento tumoral. Estes estudos indicam que o CD11b do macrófago desempenha um papel funcional crítico no controle do crescimento tumoral.

Sinais supressores de melodia inibem a expressão do CD11b

Para determinar se os sinais associados ao microambiente tumoral podem alterar a expressão do CD11b e subseqüentemente afetar a polarização de células mielóides, avaliamos o efeito dos meios de macrófagos (mCSF-, IL-4- e IFNγ/LPS) sobre a expressão do CD11b na superfície celular em macrófagos derivados da medula óssea. Enquanto a citocina imunossupressora IL-4 reduziu a expressão de CD11b, os estímulos pró-inflamatórios IFNγ/LPS melhoraram a expressão da superfície CD11b em comparação com os níveis expressos em macrófagos estimulados por mCSF (Figura suplementar 4a-b). Além disso, o fator imunossupressor TGFβ, mas não a IL-10, inibiu a expressão superficial do CD11b (Figura Suplementar 4c); TGFβ, IL-4 e meio condicionado a células tumorais (MTC) também suprimiram a expressão do mRNA do Cd11b (Figura Suplementar 4d). Importante, TGFβ e MTC reduziram a expressão da superfície celular CD11b e estimularam a transcrição imunossupressora enquanto inibiram a transcrição imunossupressora de forma reversa pelo inibidor TGFβR1 SB525334 (Figura 4e-g Suplementar). Estes dados indicam que citocinas como TGFβ no microambiente tumoral suprimem a expressão ou ativação do CD11b, promovendo assim a polarização dos macrófagos imunossupressores.

Macrofago CD11b regula a estabilidade dos vasos sanguíneos

Macrofagos não só controlam respostas imunológicas, mas também angiogênese e desmoplasia, expressando citocinas como VEGF-A e PDGF-BB, fatores de crescimento que regulam a célula endotelial e a musculatura/pericytes lisas vasculares durante a angiogênese, respectivamente2. Os vasos sanguíneos tumorais consistem frequentemente de uma única camada endotelial que carece de pericitos de suporte ou células musculares lisas; estes vasos sanguíneos são mais numerosos nos tumores do que nos tecidos normais, mas são aberrantemente formados e mal perfurados. Em contraste, em tumores com altas proporções de PDGF para VEGF, os vasos sanguíneos são revestidos por pericíticos, células mesenquimais que estabilizam os vasos e promovem melhor perfusão tumoral23,24,25,26,27. Estes tumores crescem mais rapidamente que os tumores com menores proporções de PDGF para VEGF, mas também respondem melhor à quimioterapia e imunoterapia devido à melhor perfusão tumoral24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Como os macrófagos Itgam-/- apresentavam alta PDGF e baixa expressão do gene VEGF (Fig. 1a, b), examinamos os padrões de desenvolvimento dos vasos sanguíneos nos tumores Itgam-/- e WT. Uma avaliação de padrões vasculares em tumores LLC e PyMT a partir de tumores WT e Itgam-/- ratos mostrou que os tumores de Itgam-/- apresentavam menos vasos sanguíneos, mais longos, com lúmenes mais largos e menos pontos de ramos/campo do que os tumores WT (Fig. 2a, b; Figura suplementar 5a). Os tumores de Itgam-/- tinham mais vasos sanguíneos que eram revestidos com Desmin+, NG2+, ou SMA+ pericíticos/células musculares lisas do que os tumores WT (Fig. 2a-c; Figura 5b Suplementar). Assim, esses vasos eram menos permeáveis em ratos Itgam-/- do que em ratos WT, pois menos FITC-dextran intravascular vazava para o parênquima tumoral (Fig. 2a-d). Estes dados indicam que a integrina CD11b desempenha um papel no controle da maturação dos vasos sanguíneos. Verificamos que a expressão gênica do PDGF-BB mas não do VEGF-A foi fortemente aumentada nos tumores (Fig. 2e; Figura Complementar 5c). Importante, a expressão da proteína PDGF-BB também foi elevada nos tumores Itgam-/- e macrófagos derivados de tumores em comparação aos tumores WT (Fig. 2f). Juntos, esses dados sugerem que o macrófago CD11b controla a vascularização tumoral através da expressão constitutiva de níveis elevados de PDGF.

Em apoio a essas observações sobre o papel do CD11b na neovascularização, encontramos que os ratos de Itgam-/- apresentaram um plexo vascular retinal bem desenvolvido (Fig. 5c). 2g, Isolectin B+, verde) ao nascimento (P1) comparado com ratos WT, que exibem vasculatura da retina não desenvolvida que se expande progressivamente do dia pós-natal 1 (P1) para P9. O plexo vascular superficial foi mais desenvolvido em camundongos de Itgam-/- desde o dia pós-natal P1 até o dia pós-natal P9 do que em neonatos WT (Fig. 2g). Esses resultados indicam que macrófagos e CD11b desempenham papéis-chave no controle de padrões vasculares normais.

Para investigar se o PDGF-BB elevado é responsável pelo aumento da maturação vascular e crescimento tumoral em camundongos Itgam-/-, nós tratamos os ratos WT e Itgam-/- portadores de tumores LLC com imatinibe, um inibidor do receptor PDGF-BB PDGFR1. O tratamento com imatinibe suprimiu o aumento do crescimento tumoral observado em camundongos Itgam-/- (Fig. 2h, i). Também aumentou a densidade vascular e suprimiu a normalização vascular em ratos de Itgam-/- (Fig. 2h, i). Juntos esses resultados apóiam o conceito de que a integrina CD11b modula o desenvolvimento vascular através do controle da expressão PDGF-BB.

CD11b regula a expressão de Let7a e c-Myc

CD11b pode controlar a polarização de macrófagos antiinflamatórios através da ativação de fatores de transcrição como Stat3, que podem promover a expressão de fatores imunossupressores e pró-angiogênicos como Arginase 1, Myc, e VEGF37,38,39. Itgam-/- macrófagos apresentam estat3 fosforilado constitutivamente (Fig. 3a inset); os altos níveis de expressão de fatores imunossupressores em Itgam-/- macrófagos foram reduzidos para níveis de macrófagos WT pelo tratamento com o inibidor Stat3 5,15-DPP (Fig. 3a). Surpreendentemente, entretanto, a inibição de Stat3 não afetou os altos níveis de expressão de Il6 observados em Itgam-/- macrófagos (Fig. 3a). É importante notar que a IL-6 pode ativar diretamente Stat338. Verificamos que a IL-6 promoveu o mesmo padrão de polarização imunossupressora nas células murinas e mielóides humanas e macrófagos que observamos no Itgam-/- macrófagos (Fig. 3b). Juntos, estes resultados sugerem que a IL6 autócrina pode impulsionar a polarização imunossupressora constitutiva observada em Itgam-/- macrófagos. Em apoio a este conceito, a IL6 diminuiu a expressão de Pdgfb constitutiva em Itgam-/- macrófagos (Fig. 3c). Como os TAMs são uma importante fonte de expressão de Il6 em tumores15, estes resultados sugerem que CD11b serve como um freio natural na supressão imunológica em parte através do controle da transcrição de células mielóides de Il6.

A família Let7 de microRNAs pode controlar a expressão Il6 em células tumorais e inflamatórias40,41. Os microRNAs são RNAs não codificadores que modulam a expressão gênica a nível pós-transcritivo interferindo na tradução ou estabilidade do RNA e podem ter um impacto dramático na supressão imunológica e angiogênese tumoral42,43. Verificamos que a expressão do miRNA Let7a está inversamente correlacionada com a expressão do Il6 em macrófagos murinos e humanos (Figura Complementar 6a-b). Portanto, perguntamos se a perda da expressão do CD11b em macrófagos afeta a expressão de Let7a. A expressão de Let7a foi ablacionada em macrófagos transduzidos por Itgam-/- e Itgam siRNA e na presença de anticorpos CD11b neutralizantes (Fig. 3d; Figura Complementar 6c) de forma independente de Lin28, uma proteína de ligação do RNA que cliva e inativa Let7, pois os níveis de Lin28 não foram afetados pela expressão ou ativação do CD11b (Figura Complementar 6b, d-e). A ligadura CD11b pelo ICAM-1 promoveu a expressão de Let7a dependente do tempo, enquanto inibia a expressão de Il6; inversamente, a supressão da adesão inibiu a expressão de Let7a e promoveu a expressão de Il6 tanto no murino quanto nos macrófagos humanos (Fig. 3e, f). Importante, a expressão ectópica de Let7a miRNA (pré-miRNA) inibiu a expressão de genes imunossupressores e estimulou a expressão de genes pró-inflamatórios em macrófagos Itgam-/-, enquanto que a expressão anti-miRNA Let7a estimulou a expressão de genes imunossupressores e inibiu a expressão de genes imunossupressores em macrófagos WT (Fig. 3g). Similar à ablação do CD11b (Fig. 1a), o anti-miRNA Let7a estimulou a expressão do Pdgfb, mas não teve efeito na expressão do Vegfa (Fig. 3h). Juntos, estes resultados indicam que a ativação do CD11b promove a expressão do MiRNA Let7a, que por sua vez inibe a expressão do gene de macrófago imunossupressor IL6.

c-Myc, um fator de transcrição que regula a polarização do macrófago imunossupressor, liga-se ao promotor Let7 e suprime sua transcrição; curiosamente Let7 também pode suprimir a expressão do gene c-Myc44,45. Verificamos que o gene c-Myc foi upregulado nos macrófagos Itgam-/- em comparação com os macrófagos WT (Fig. 3i). A expressão da proteína c-Myc e a fosforilação serina 62, que estabiliza o fator de transcrição46, também foram upreguladas nos macrófagos Itgam-/- em comparação com os macrófagos WT (Fig. 3j). Perguntamos então se a inibição da função cMyc poderia promover a expressão de Let7 e assim alterar a polarização dos macrófagos. Importante, a expressão de Let7a, Let7d, e Let7f foi reduzida em Itgam-/- macrófagos; entretanto, a inibição farmacológica da expressão de Let7 c-Myc restaurou a expressão de Let7 em Itgam-/- macrófagos e reverteu o aumento da expressão do gene imunossupressor exibido por Itgam-/- macrófagos (Fig. 3k, l). Juntos, esses dados indicam que a integrina CD11b funciona para suprimir a expressão de Myc e a polarização imunossupressora de macrófagos de forma dependente de Let7.

Porque Let7a inibe a expressão de Pdgfb mediada por macrófagos, investigamos o efeito da expressão de Let7a na neovascularização in vitro e in vivo. Células endoteliais e células musculares lisas vasculares presas a microesferas portadoras foram cultivadas em géis de fibrina que continham WT ou Itgam-/- macrófagos que foram transduzidos com miRNA de controle, Let7a pré-miRNA, Let7a anti-miRNA ou Pdgfb-bb siRNA. Itgam-/- macrófagos estimulavam alongamento de broto que era inibido pela transdução de macrófagos com miRNA de Let7a ou siRNA de Pdgfb (Fig. 4a, b; Figura Complementar 6f). Em contraste, a expressão do antimiRNA Let7a em WT mas não Itgam-/- macrofagos estimulou o alongamento de brotos (Fig. 4a, b; Figura 6f Suplementar). Adicionalmente, macrófagos transduzidos com anti-miR Let7a estimularam a formação de vasos sanguíneos maduros, pericilados em Matrigel in vivo saturado com bFGF (Fig. 4c). Juntos, esses estudos mostram que o CD11b controla a neovascularização através da regulação de Let7a e posterior expressão PDGF-BB.

Célula mielóide Let7a regula a progressão tumoral

Para testar o papel de Let7a na regulação da supressão imunológica e neovascularização tumoral, entregamos Let7a anti-miR a tumores em nanopartículas alvo de células mielóides in vivo (Fig. 4d). Descobrimos que as nanopartículas alvo da integrina αvβ3 foram especificamente absorvidas por células mielóides circulantes em animais normais e portadores de tumores (Figura Complementar 7a-h). O fornecimento de anti-miRNA Let7a estimulou o crescimento do tumor LLC, comparável ao observado em ratos de Itgam-/- (Fig. 4d). Embora Let7a seja expressa em células imunes e não imunes em tumores, encontramos que a entrega de Let7a anti-miRNA só inibiu a expressão de Let7a em monócitos circulantes e em macrófagos associados ao tumor, mas não em outras células associadas ao tumor (Fig. 4e). Importante, o anti-miRNA Let7a estimulou a expressão de genes imunossupressores e pró-angiogênicos e inibiu a expressão de genes pró-inflamatórios em tumores em comparação com os controles (Fig. 4f, Figura 8a Suplementar). O antimiRNA Let7a também estimulou a normalização dos vasos sanguíneos em tumores transfectados, já que os vasos eram mais longos, menos ramificados, fortemente revestidos com pericíticos e menos vazados que os vasos de controle de tumores transfectados (Fig. 4g, h). Importante, o anti-Let7a também suprimiu o recrutamento de células T CD8+ para tumores e melhorou o recrutamento de células T CD4+ para tumores (Fig. 4i). Juntos, estes resultados indicam que o CD11b restringe a supressão imunológica e maturação vascular através da sua regulação do miRNA Let7a. Estudos anteriores mostraram que o aumento da normalização vascular nos tumores pode melhorar a perfusão tumoral e promover responsividade à terapia23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Para determinar se a normalização vascular induzida pelo anti-miRNA Let7a pode melhorar a eficácia da quimioterapia aumentando a perfusão tumoral, tratamos camundongos portadores de tumores LLC com entrega orientada de anti-miRNA Let7a ou controle do miRNA em combinação com quimioterapia (gemcitabina) (Fig. 4j). Enquanto o anti-miRNA Let7a promoveu o crescimento do tumor LLC, o anti-miRNA Let7a combinado com gemcitabina reduziu substancialmente o crescimento tumoral, consistente com a noção de que a inibição de Let7a aumenta o acesso do tumor à quimioterapia (Fig. 4k). De acordo com estes resultados, descobrimos que o tratamento com gemcitabina de ratos com Itgam-/- suprimiu mais profundamente o crescimento tumoral do que o tratamento com gemcitabina de ratos WT (Figura 8b Suplementar). Como Itgam-/- exibiu maior perfusão (menor vazamento vascular) que ratos WT (Figura 8c Suplementar), esses estudos indicam que o CD11b, através de seus efeitos no miRNA Let7a, tem um papel crítico na regulação das respostas imunes e vasculares do tumor.

O agonista CD11b LA1 inibe o crescimento tumoral

Nossos resultados sugeriram que a ativação farmacológica direcionada do CD11b in vivo poderia repolarizar os macrófagos associados ao tumor, com subseqüente inibição da supressão imunológica do tumor e seu crescimento. Assim, investigamos os efeitos de uma pequena molécula agonista de CD11b, leucaderina 1 (LA1)47,48 (Fig. 5a) sobre a polarização dos macrófagos e o crescimento tumoral. O LA1 estimulou a adesão de células mielóides a substratos revestidos de ICAM-1 de forma inibida por anticorpos anti-CD11b-neutralizantes (Fig. 5b). LA1 estimulou a expressão do gene de resposta imune de macrófagos, ilustrada por aumentos na expressão de Il1b, Tnfa, Il12, Nos2, e Ifng mRNAs (Figura Suplementar 9a). Como o LA1 estimulou a expressão de Let7a e inibiu a expressão de Pdgfb e Il6 (Fig. 5c), estes resultados sugeriram que o LA1 poderia estimular respostas imunológicas pró-inflamatórias que poderiam inibir o crescimento tumoral in vivo. Para avaliar os efeitos do LA1 sobre os macrófagos associados ao tumor in vivo, os macrófagos associados ao tumor foram isolados10, tratados com LA1 previamente e co-implantados com células tumorais LLC. Macrófagos tratados com LA1 inibiram completamente o crescimento tumoral (Fig. 5d, e) mesmo que o LA1 não tivesse efeito direto sobre a LLC ou viabilidade dos macrófagos (Fig. 5e, f). Embora o LA1 não tenha tido efeito no crescimento de células tumorais de mama CL66-Luc in vitro (Figura 9b suplementar), o LA1 reduziu potentemente o crescimento tumoral em tumores de mama sintéticos, implantados ortotopicamente CL66-Luc de forma mais eficaz do que o taxol (Fig. 5g). O LA1 também foi sinergizado com irradiação para suprimir o crescimento do tumor mamário CL66-Luc (Fig. 5h) e suprimir o crescimento de tumores ortotópicos, humanos MDA-MB-231 (Fig. 5i). É importante ressaltar que o LA1 inibiu o crescimento do tumor pulmonar murino LLC no WT mas não em ratos Itgam-/-, indicando que o LA1 atua através da integrina CD11b para suprimir o crescimento de tumores (Fig. 5j, k).

Como o tratamento LA1 aumentou a presença de MHC-II + macrófagos, tipicamente considerados imunologicamente competentes, e diminuiu a presença de CD206+ macrófagos, tipicamente considerados imunossupressores, em tumores LLC e CL66-Luc (Figura Suplementar 9c-d), nossos estudos sugerem que o LA1 repolariza macrófagos associados ao tumor. Assim, verificamos que o LA1 inibiu a expressão de S100A8 e MMP9 em células CD11b+ em tumores LLC e também inibiu a expressão de Arginase1, S100A8 e MMP9 em tumores CL66-Luc (Figura Suplementar 9e-f). Como essas proteínas são marcadores de macrófagos pró-tumorais, juntos esses estudos indicam que o LA1 provavelmente inibe o crescimento tumoral ao repolarizar os macrófagos associados ao tumor. De fato, o tratamento com LA1 aumentou a presença de células CD8 + T em tumores LLC e CL66-Luc (Figura Suplementar 10a-c). Também observamos que o tratamento com o LA1 alterou a neovascularização dos tumores diminuindo o número de SMA + vasos sanguíneos (Fig. 5l). Ao melhorar o perfil imunológico pró-inflamatório dos tumores e inibir a normalização vascular nos tumores, a pequena molécula CD11b agonista LA1 alterou significativamente a polarização dos macrófagos, aumentou o recrutamento de células T CD8+ para tumores e inibiu a progressão tumoral em modelos de camundongos com câncer de murino e humano.