MICROBIOLOGIA DA CARNE
Isolamento de bacteriocina-produção de bactérias lácticas produtoras de bacteriocinas a partir de carnes e produtos cárneos e seu espectro de atividade inibitória
Isolamento de bactérias lácticas produtoras de bacteriocinas a partir de carnes e produtos cárneos e seu espectro de atividade inibitória
Renata Bromberg; Izildinha Moreno; Cíntia Lopes Zaganini; Roberta Regina Delboni; Josiane de Oliveira
Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas, SP, Brasil
Correspondência
ABSTRACT
Um total de 285 amostras de carne e produtos cárneos foram avaliados para a presença de bactérias produtoras de ácido láctico bacteriocinas através do teste “sanduíche”. De 174 destas amostras, foram isoladas 813 estirpes de bactérias produtoras de ácido láctico. Elas foram capazes de inibir o crescimento de Staphylococcus aureus CTC 33 e/ou Listeria innocua Lin 11. Quando avaliadas pelo ensaio de bem-difusão, 128 dessas cepas inibiram o crescimento das cepas indicadoras. Os espectros inibitórios de atividade dos isolados foram avaliados contra uma gama de organismos de teste Gram-positivos e Gram-negativos. S. aureus foi o indicador mais sensível testado, enquanto Enterococcus faecalis e Lactobacillus plantarum foram os mais resistentes. Todos os compostos produzidos pelas bactérias lácticas foram total ou parcialmente inactivados por algumas das enzimas proteolíticas, o que indica a sua natureza proteica. A atividade antimicrobiana das bacteriocinas produzidas pelas bactérias do ácido láctico isoladas neste trabalho poderia atuar como uma barreira potencial para inibir o crescimento de bactérias de deterioração e patógenos de origem alimentar.
Palavras-chave: bacteriocinas, bactérias do ácido láctico, carne, atividade inibitória.
RESUMO
Um total de 285 amostras de carnes e produtos cárneos foi avaliado para detecção de culturas produtoras de bacteriocinas pelo método do “sanduíche”. A partir de 174 destas amostras, 813 linhagens de bactérias lácticas com atividade inibitória sobre Staphylococcus aureus CTC 033 e/ou Listeria innocua Lin 11 foram isoladas. Quando examinadas pelo método de antagonismo simultâneo em poços, 128 destas linhagens inibiram o crescimento dos microrganismos indicadores. O espectro de atividade das linhagens isoladas foi avaliado com diversos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. De um modo geral, S. aureus foi o microrganismo indicador mais sensível, enquanto Enterococcus faecalis e Lactobacillus plantarum foram os mais resistentes. Todos os compostos antimicrobianos produzidos pelas bactérias lácticas testadas foram completa ou parcialmente inativados por enzimas proteolíticas, o que indica sua natureza protéica. A atividade antimicrobiana das bacteriocinas produzidas pelas linhagens de bactérias lácticas isoladas neste trabalho pode atuar como uma barreira potencial para inibir o crescimento de bactérias deterioradoras e patogênicas de origem alimentar.
Palavras-chave: bactérias lácticas, bacteriocinas, carne, atividade inibitória.
INTRODUÇÃO
Recentemente têm sido feitas tentativas para aplicar técnicas de biopreservação a produtos cárneos (18). Estas têm envolvido a introdução de uma microflora competitiva de bactérias lácticas como culturas protetoras para produtos de carne, incluindo bactérias produtoras de bacteriocina ácida láctica e bacteriocinas anti-listeriais purificadas (12). Considerando que as bactérias produtoras de bacteriocina são isoladas de alimentos que normalmente contêm bactérias do ácido láctico, como a carne e os produtos lácteos, são consumidas há muito tempo. As bacteriocinas produzidas por bactérias produtoras de ácido láctico são definidas como produtos primários ou modificados extracelulares de síntese bacteriana ribossomal, que podem ter um espectro relativamente estreito de actividade bactericida (4). As estirpes produtoras de bacteriocinas podem ser utilizadas como parte ou coadjuvantes de culturas iniciais de alimentos fermentados, a fim de melhorar a segurança e qualidade. Neste contexto, as bacteriocinas produzidas por bactérias lácticas associadas à carne, tais como Pediococcus, Leuconostoc, Carnobacterium e Lactobacillus spp., têm provavelmente um potencial muito maior como conservantes de carne (3,31,33,38). A possibilidade de exploração de bacteriocinas na fermentação de alimentos surge quando o espectro inibitório inclui a deterioração dos alimentos e/ou microrganismos patogénicos, dando à estirpe produtora uma vantagem competitiva no alimento. Uma vantagem importante das bacteriocinas sobre os antibióticos clássicos é que as enzimas digestivas as destroem (4). Este facto indica que a ingestão destes compostos não irá alterar a ecologia do tracto digestivo e também que não irá causar riscos relacionados com o uso de antibióticos comuns.
Bacteriocinas poderiam ser aplicadas na tecnologia de barreira, que aproveita as sinergias dos tratamentos combinados para preservar os alimentos de forma mais eficaz (6). O uso de nisina, uma bacteriocina produzida por Lactococcus lactis ssp., é actualmente permitido em cerca de 50 países. No entanto, alguns pesquisadores concluíram que a nisina não é eficaz na aplicação da carne devido ao pH elevado (24), à dificuldade de distribuir uniformemente a bacteriocina pelos alimentos e à interferência de componentes da carne como os fosfolípidos (8) e o glutatião (26). Devido às dificuldades na utilização da nisina em aplicações de carne, a procura de novas culturas produtoras de bacteriocina deve continuar.
O objectivo deste estudo foi o de analisar uma gama de carne e produtos cárneos para detectar a presença de estirpes produtoras de bacteriocina que possam ser valiosas para uso em estratégias de biopreservação de produtos cárneos. Assim, foi avaliado o potencial dos isolados em inibir a deterioração dos alimentos e bactérias patogénicas de origem alimentar.
MATERIAIS E MÉTODOS
Estirpes bacterianas e meios de crescimento
As estirpes utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 1. As bactérias escolhidas como indicadores foram Staphylococcus aureus CTC 33 (Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL, Campinas, Brasil), Listeria innocua Lin 11 (Instituto Pasteur, Paris, França), e Bacillus cereus CTC 1 (ITAL). Como controle positivo foi utilizado o Lactobacillus casei LC 705 (Wiesby), produtor de bacteriocina. As culturas de caldos de bactérias lácticas e os outros microorganismos foram mantidos a -80ºC no caldo de Man Rogosa Sharpe (MRS, Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) ou no caldo de soja Trypticase Soya (TSB, Oxoid) suplementado com 15% de glicerol. As culturas de trabalho foram preparadas como slants em ágar MRS para bactérias lácticas ou ágar TSA com suplemento de 0,6% de extracto de levedura (Oxoid) para os indicadores, e armazenado a 4ºC. As culturas para experimentos foram revestidas uma vez por semana e inoculadas em meio de uma única colônia e incubadas por 24 h. Antes do uso, as culturas de bactérias lácticas foram transferidas duas vezes para o meio apropriado, e incubadas de acordo com as condições mostradas na Tabela 1.
Amostras
Duzentas e oitenta e cinco amostras de uma variedade de carnes e produtos cárneos obtidos de diferentes fabricantes brasileiros foram analisados. Foram incluídas carnes frescas, cruas, cozidas, amadurecidas, secas ou fermentadas. Após a compra no mercado de varejo, todas as amostras foram armazenadas a 3 ± 1ºC por um período máximo de 24 h antes da análise.
Isolamento das bactérias produtoras de bacteriocina do ácido láctico da carne
Uma porção de 25 g de cada amostra de carne foi transferida assepticamente para um saco estomacal estéril e foram adicionados 225 mL de água peptonada tamponada (BPW, Oxoid) para obter uma diluição de 1:10. As amostras foram misturadas durante 1 min usando um Stomacher (Modelo 400 – BA 7021, Seward Medical, Londres, Reino Unido). As diluições seriais das amostras foram feitas em água peptona a 0,1%. Para detecção de atividade antagônica, foi utilizado um teste “sanduíche” (37). Para este efeito, as diluições foram inoculadas (verter placa) em ágar MRS suplementado com sodiumazida 0,01% para inibir bactérias Gram-negativas. A atividade inibidora do peróxido de hidrogênio foi eliminada pela adição de catalase (Sigma Chemical Co., Dorset, UK) a uma concentração final de 100 U. Para descartar qualquer inibição devido à redução do pH causada pela produção de ácido orgânico, 2% de b-glicerofosfato de sódio (Ecibra, Brasil) foi adicionado ao ágar MRS. As placas foram sobrepostas com o mesmo meio para excluir a inibição por bacteriófagos líticos, que são entidades não difusoras, seguidas de incubação aeróbica a 35ºC durante 48 h para permitir o desenvolvimento das colônias.
Após o período de incubação, placas contendo até 102 UFC foram sobrepostas com 4,5 mL de TSB mole (contendo 0,75% de ágar). O ágar sobreposto foi semeado com 500 ml de S. aureus CTC 33 ou L. inocua Lin 11 a um nível de 106 a 107 UFC/mL. As placas foram incubadas a 35ºC durante 24 h. A lise das estirpes indicadoras resultou numa zona clara. As colônias mostrando zonas de inibição foram transferidas para TSB e incubadas a 30ºC por até 72 h. As culturas foram purificadas em placas de ágar MRS e incubadas a 30ºC por 18 h. Os isolados purificados foram examinados por coloração de Gram e produção de catalase, doseados de acordo com Harrigan e McCance (10).
Detecção da actividade antagonista
Produção de bacteriocina pela bactéria do ácido láctico isolada da carne e produtos cárneos foi testada pelo método de bem-difusão do ágar de acordo com Benkerroum et al. (1), sendo esta uma modificação da descrita por Tagg e McGiven (35). As placas foram examinadas para lise ao redor dos poços em diferentes intervalos de tempo para um total de 24 h. Foi feita uma comparação direta entre os diâmetros das zonas de inibição produzidas por diferentes cepas.
Espectro de actividade inibitória da bacteriocina
Culturas produtoras de bacteriocina isoladas da carne e dos produtos cárneos também foram testadas contra as estirpes de bactérias mostradas na tabela 1. O ensaio de bem-difusão foi utilizado como descrito anteriormente. As estirpes que apresentaram um amplo espectro de actividade também foram testadas usando o ensaio de diluição crítica de Mayr-Harting et al. (19). O título foi definido como o recíproco da diluição mais alta mostrando uma inibição da estirpe indicadora multiplicada por 100 para expressar os resultados como unidades de atividade por mililitro (AU/mL).
Sensibilidade da substância semelhante à bacteriocina às enzimas
Supernatantes livres de células das culturas de ácido láctico foram coletados por centrifugação (7.500 g, 10 min, 4ºC) de culturas de caldo de MRS durante a noite. Os sobrenadantes líquidos foram ajustados para pH 6,5 com 10 N NaOH e expostos ao calor (95ºC durante 5 min) em banho-maria em ebulição. Os sobrenadantes foram tratados com as seguintes enzimas a uma concentração final de 0,2 mg/mL: ficina (Sigma Chemical Co., Dorset, Inglaterra) em 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,0; tripsina (Sigma) em 40 mM Tris-HCl, pH 8,2; a-quimotripsina (Sigma) em 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; pronase E (Sigma) em 20 mM Tris-HCl, pH 7.8; pepsina (Merck Darmstad, Alemanha)em 0,002 N HCl; lipase (Merck) em 0,1 M de fosfato de potássio, pH 6,0; papaína (Sigma) em 0,05 M de acetato de fosfato de sódio, pH 7,0. Todas estas soluções foram esterilizadas por filtros Millex GV 0,22 m (Millipore S.A., St. Quentin-en-Yvelines, França) e depois adicionadas a sobrenadantes estéreis sem células (v/v, 1/1). Os controles consistiram em soluções enzimáticas sem bacteriocina e apenas sobrenadante livre de células em tampão de fosfato de sódio 0,1 M. As amostras e controlos foram incubados a 37ºC durante 2 h e aquecidos em água a ferver durante 5 min para inactivar as enzimas. A atividade bacteriocina restante foi determinada pelo ensaio de diluição crítica de Mayr-Harting et al. (19) como descrito anteriormente, usando B. cereus CTC 1 como estirpe indicadora.
RESULTA E DISCUSSÃO
Isolamento e rastreio bacteriológico
As bactérias produtoras de bacteriocina isoladas da carne e dos produtos estão bem adaptadas a estas condições, elas podem assegurar a segurança e prolongar o prazo de validade destes alimentos. Portanto, foi feita uma busca por atividades antagônicas contra a deterioração dos alimentos e bactérias patogênicas, em isolados a partir de uma gama de carnes e produtos cárneos.
De acordo com os resultados, de um total de 285 amostras diferentes de carne fresca e produtos cárneos analisados, 174 apresentaram estirpes de bactérias lácticas que foram encontradas para produzir substâncias semelhantes à bacteriocina pelo teste “sanduíche”. De cada uma destas amostras, pelo menos 4 colónias capazes de inibir S. aureus CTC 33 e/ou L. inocua Lin 11 foram isoladas, representando um total de 813 colónias. De Martinis et al. (7) analisaram vinte amostras de carne e produtos cárneos brasileiros e isolaram quatro bactérias produtoras de bacteriocina ácida láctica que apresentavam atividade antilisterial.
Após a purificação, as culturas foram então verificadas para a produção de bacteriocinas utilizando o ensaio de bem-difusão. Usando este método, através da inoculação dos poços com culturas de caldos de vários microrganismos indicadores, podem ser feitas comparações entre a produção de bacteriocinas de diferentes estirpes que crescem sob condições idênticas. Dos 813 isolados, apenas 128 (15,7%) produziram zonas de inibição no ágar MRS. Estas estirpes produtoras de bacteriocina foram todas Gram-positivas e catalase negativas, sendo 75,8% cocos e 24,2% varas. Schillinger e Lücke (28) obtiveram resultados similares na verificação das cepas de Lactobacillus que foram positivas no teste de mancha de ágar e negativas no ensaio de bem-difusão: de um total de 19 cepas, apenas seis produziram zonas de inibição no ágar no ensaio de bem-difusão. Lewus et al. (16) descobriram que apenas algumas das cepas que deram resultado positivo no teste de spot-on-the-lawn no ensaio de bem-difusão. Eles consideraram que dar algum tempo para as bacteriocinas se difundirem no ágar antes da incubação, ou aumentar o tamanho do poço para que mais amostra pudesse ser aplicada, poderia aumentar a sensibilidade do ensaio. Segundo estes autores, a agregação, as bacteriocinas não-difusíveis, a inativação da protease e os efeitos da concentração, podem levar a resultados falso-negativos no ensaio de difusão do poço.
Os resultados do ensaio de bem-difusão mostraram que 64,1% das cepas isoladas só inibiram S. aureus, e 11,7% só mostraram atividade inibitória contra L. inocua, enquanto 24,2% das isoladas de carne que inibiram S. aureus também inibiram L. inocua. De acordo com Lewus et al. (16), o microorganismo indicador utilizado na triagem inicial precisa refletir a aplicação final ou proposta da cepa produtora de bacteriocina. S. aureus e Listeria sp. estão frequentemente presentes em tecidos frescos, porque o processo de abate não inclui uma etapa bactericida. O crescimento de S. aureus nos alimentos apresenta um risco potencial para a saúde pública, uma vez que muitas estirpes de S. aureus produzem enterotoxinas que causam intoxicações alimentares se ingeridas. Carne e produtos cárneos estão normalmente associados a intoxicações alimentares estafilocócicas (25,36). Foram encontradas espécies de Listeria em carne e produtos cárneos (13). A transmissão alimentar de L. monocytogenes tem sido implicada em surtos humanos de listeriose envolvendo o consumo de vários alimentos (9,17,29). L. inocua é frequentemente isolada da carne, e muitas vezes a incidência deste organismo é superior à de L. monocytogenes (2). O uso de espécies de Listeria que não L. monocytogenes como indicadores da presença deste organismo tem sido proposto (39).
Fig. 1 mostra os grupos de amostras de carne e produtos cárneos que apresentaram bactérias produtoras de ácido láctico tipo bacteriocina, de acordo com o teste “sanduíche” e o ensaio de bem-difusão. No entanto, nem todas as bactérias isoladas pelo teste “sanduíche” foram confirmadas no ensaio de bem-difusão. O teste “sanduíche” apresentou 174 (61,0%) amostras positivas para organismos produtores de bacteriocinas, das quais apenas 55 (31,1%) deram positivo no ensaio de difusão no poço. De acordo com o teste “sanduíche”, a maioria das bactérias produtoras de bacteriocina foram isoladas de produtos de carne maduros, secos ou fermentados (78,4%). O mesmo não se observou no ensaio de “bem-difusão”: a carne fresca tinha o maior número de bactérias produtoras de bacteriocina (27,5%). Por outro lado, ambos os métodos mostraram que os produtos de carne cozida continham menos amostras com bactérias ácido-lácticas positivas para substâncias semelhantes à bacteriocina.
Estes resultados negativos poderiam mostrar que a produção de bacteriocinas não é altamente conservada nestas estirpes. Algumas das bacteriocinas são proteínas mediadas por plasmídeos (34), portanto deve-se considerar a possibilidade de que algumas culturas possam ter perdido seus plasmídeos após transferências consecutivas durante a purificação.
Spectra de atividade inibitória
Atividade contra 18 cepas indicadoras, dos compostos antibacterianos produzidos pelos isolados bacterianos, é mostrada na (Tabela 2). Estas cepas apresentaram um amplo espectro inibitório, já que foram capazes de inibir muitas das cepas indicadoras testadas. Estes dados sugerem que vários microrganismos indicadores diferentes devem ser usados nos testes de bacteriocinética, para evitar a falta de um produtor. De todas as cepas indicadoras testadas, S. aureus CTC 33, Cl. sporogenes CTC 6, e B. cereus CTC 1 foram as mais sensíveis, sendo inibidas pelo maior número de culturas, enquanto que Ent. faecalis ATCC 19433, Lb. plantarum TECNOLAT 434, clostridia redutora de sulfito CTC 5, Leuc. mesenteroides ATCC 10830, e W. viridescens CCT 849 foram inibidas por um número menor de cepas. Das estirpes testadas para a produção de bacteriocina, nenhuma mostrou atividade inibitória contra todos os indicadores. Apenas 4 cepas (CTC 165, CTC 376, CTC 469 e CTC 484), inibiram a maioria das cepas indicadoras testadas (dados não mostrados).
A maior parte da inibição causada pelas cepas de ácido láctico produziu zonas de inibição “baixas” (o raio da zona livre foi inferior a 3 mm). Lb. helveticus (Wiesby) foi um indicador muito sensível, já que 90,2% da inibição causada pelas bacteriocinas testadas sobre esta bactéria produziram zonas de inibição “altas” (o raio da zona livre foi superior a 5 mm). As culturas que produziram zonas de “alta” inibição contra as estirpes indicadoras foram: CTC 3, CTC 12, CTC 35, CTC 36, CTC 38, CTC 40, CTC 49, CTC 51, CTC 78, CTC 141, CTC 142, CTC 144, CTC 172, CTC 176, CTC 185, CTC 204, CTC 205, CTC 206, CTC 210, CTC 211, CTC 212, CTC 231, CTC 253, CTC 330, CTC 346, CTC 352, CTC 359, CTC 375, CTC 376, CTC 377, CTC 378, CTC 396, CTC 404, CTC 469, CTC 483, CTC 484, e CTC 485 contra Lb. helveticus; estirpes CTC 78 e CTC 172 contra B. cereus CTC 001; estirpe CTC 172 contra Cl. sporogenes CTC 006; e estirpe CTC 332 contra Cl. perfringens CTC 42.
Algumas estirpes produziram substâncias do tipo bacteriocina que inibiram as bactérias Gram-negativas testadas: Pseudomonas sp. CTC 32 foi inibido por 61 (47,6%) cepas, E. coli ATCC 25422 por 49 (38,3%) cepas, e Salm. typhimurium ATCC 14028 por 48 (37,5%) cepas. O alvo das bacteriocinas é a membrana citoplasmática, portanto, devido à barreira protetora proporcionada pelo LPS da membrana externa das bactérias Gram-negativas, as bacteriocinas geralmente só são ativas contra as células Gram-positivas (32). Entretanto, estirpes mutantes ou protoplastos de bactérias Gram-negativas tornaram-se sensíveis à ação das bacteriocinas após exposição a estresse subletais, como aquecimento, congelamento ou descongelamento, que perturbam a membrana externa e permitem o acesso das bacteriocinas à membrana citoplasmática, levando a um aumento da sensibilidade (11,30,32).
Das 128 culturas testadas para atividade antimicrobiana, as 12 que inibiram o maior número de indicadores foram testadas usando o ensaio de Mayr-Harting et al. (19) (Tabela 3). De acordo com os resultados, B. cereus CTC 1 e L. monocytogenes CTC 21 foram os microrganismos mais sensíveis testados uma vez que as cepas de ácido láctico analisadas inibiram 100% e 91,7% das mesmas, respectivamente. Foi observada uma variação em relação ao nível de inibição entre as cepas indicadoras testadas. O W. viridescens CCT 849 foi o mais resistente, uma vez que apresentou o menor valor de atividade. B. cereus ATCC 14579, Leuc. mesenteroides ATCC 10830, e o clostridia redutora de sulfito CCT 5, apresentaram um padrão de sensibilidade intermediário, enquanto S. aureus CTC 33, L. inocua Lin 11, L. monocytogenes CTC 21, e Cl. perfringens CTC 42 foram bactérias menos resistentes. Os microorganismos mais sensíveis, B. cereus CTC 1, Ent. faecalis ATCC 19433, e Lb. helveticus (Wiesby) mostraram as maiores sensibilidades contra alguns dos produtores. Entre os produtores, as cepas CTC 210 e CTC 404 apresentaram menores valores de atividade de inibição, enquanto as cepas CTC 469, CTC 483, e CTC 485 apresentaram a maior atividade. Das cepas testadas, as CTC 164 e CTC 469 apresentaram os espectros de atividade mais amplos, já que foram capazes de inibir 44,4% das culturas indicadoras.
alguns dos microrganismos que apresentaram sensibilidade às estirpes testadas através do ensaio de bem-difusão, como as espécies Gram-negativas (E. coli ATCC 25422, Pseudomonas sp. CTC 32, e Salm. typhimurium ATCC 14028), Cl. sporogenes CTC 6, Micrococcus sp. ATCC 4698, Lb. plantarum TECNOLAT 434, e Streptococcus sp. ATCC 25175, não foram inibidos no ensaio Mayr-Harting et al. (19). Apenas B. cereus CTC 1 exibiu o mesmo padrão de sensibilidade quando analisado por ambos os métodos.
Inibição da cultura do indicador foi maior usando o ensaio de bem-difusão. Como tanto as culturas produtoras quanto os indicadores cresceram ao mesmo tempo, a inibição poderia ser causada por uma competição por nutrientes dos meios de cultura. O uso de sobrenadantes livres de células no ensaio Mayr-Harting et al. (19) poderia evitar este problema.
Sensibilidade às enzimas proteolíticas e lipolíticas
A sensibilidade das substâncias antibacterianas produzidas pelas bactérias ácido-lácticas à a quimotripsina, tripsina, pronase E, ficina, pepsina, papaína e lipase foi determinada em condições controladas e reprodutíveis mostradas na (Tabela 4). Todos os compostos foram total ou parcialmente inactivados por algumas das enzimas proteolíticas, o que indica a sua natureza proteica.
Em geral, os compostos inibidores produzidos por essas cepas apresentaram diferentes padrões de sensibilidade. Todas elas foram completamente inativadas por a quimotripsina, pronase E, e ficina. Apenas uma era resistente à tripsina (estirpe CTC 141), enquanto a substância produzida pela estirpe CTC 204 perdeu 75% de sua atividade após o tratamento com esta enzima. Alguns autores diferenciam a nisina de outras bacteriocinas lactocócicas pelo fato de a quimotripsina ser a única enzima proteolítica à qual a nisina é sensível (14,22). Entretanto, esta propriedade deve ser considerada com cautela, uma vez que outros autores relataram que a nisina também pode ser inativada por outras enzimas como a pronase E (15,23), e a ficina (5,21).
Pepsina inibiu a atividade antagônica de 75% das cepas (CTC 141, CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 396, CTC 404, CTC 483, CTC 484, e CTC 485). A sensibilidade à pepsina foi demonstrada em outras bacteriocinas: plantaricina 35d (20), sakacina A (28) e enterocina 416KI (27). A papaína não afetou a atividade das substâncias antibacterianas produzidas pelas cepas CTC 141 e CTC 404, enquanto que esta enzima inativou as outras.
Os compostos produzidos pelas cepas CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 483, CTC 484, e CTC 485, foram total ou parcialmente inativados após o tratamento com lipase, indicando que estas substâncias inibidoras podem ter uma fragilidade lipídica na sua composição química.
É interessante notar que os compostos produzidos por essas cepas foram inativados por um conjunto de enzimas proteolíticas, incluindo as de origem pancreática (tripsina e a quimotripsina) e muitas vezes de origem gástrica (pepsina). Com base na definição de bacteriocinas de bactérias Gram-positivas dada por Tagg et al. (34) e Klaenhammer (14) e usando as propriedades observadas nas bacteriocinas de bactérias lácticas (22), os compostos antibacterianos produzidos pelas cepas presentes podem ser classificados como bacteriocinas. O padrão de sensibilidade da protease indica a singularidade das bacteriocinas produzidas pelos isolados e que as estirpes são diferentes. Embora algumas das bacteriocinas apresentem um padrão semelhante de sensibilidade à protease, como entre CTC 210 e CTC 484 ou CTC 352 e CTC 469, não partilham um espectro de actividade idêntico.
Os resultados mostraram que 61% das amostras de carne analisadas apresentavam bactérias produtoras de bacteriocina ácida láctica com potencial para inibir microorganismos nocivos, como L. monocytogenes, S. aureus, e bactérias esporuladas. A atividade antimicrobiana das bacteriocinas produzidas pelas bactérias do ácido láctico isoladas nesta pesquisa poderia atuar como uma barreira para inibir a deterioração dos alimentos e/ou o crescimento de microrganismos patogênicos nos alimentos. Estão em curso mais trabalhos para avaliar a natureza destas substâncias e a sua aplicabilidade em técnicas de biopreservação da carne.
ACONTECIMENTOS
Os autores agradecem à FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio financeiro (Processo 99/12314-0).
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