Lesão Cerebral Subclínica Causada pela Infecção pelo Vírus da Influenza H5N1

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Vírus da Influenza Humana geralmente infectam o sistema respiratório superior, causando espirros, corrimento nasal e tosse, assim como febre, mal-estar e artralgia (22). Além disso, complicações neurológicas também têm sido relatadas quando um novo subtipo de vírus da influenza é introduzido na população humana, como exemplificado pelas pandemias espanhola (1918) e asiática (1957) (2-4, 6, 10, 18, 22).

Em 1997, o vírus da influenza H5N1, que se originou em aves de capoeira, causou um surto em humanos. Desde então, mais de 500 pessoas foram infectadas com o vírus H5N1 em todo o mundo, com uma taxa de mortalidade de aproximadamente 60% (21). A infecção pelo vírus H5N1 humano geralmente se manifesta como pneumonia grave, que progride para a síndrome do desconforto respiratório agudo; no entanto, algumas vítimas do vírus H5N1 já sofreram envolvimento neurológico (1). O RNA e antígenos virais do H5N1 foram detectados no cérebro dos pacientes, e o próprio vírus foi isolado do líquido cefalorraquidiano (5, 7). Estes dados sugerem que alguns vírus H5N1 podem causar encefalite em humanos, como ocorreu nas fases iniciais das pandemias espanhola e asiática.

Ferrets representam um modelo mamífero útil de infecção por influenza, pois são altamente suscetíveis à infecção por vírus influenza e desenvolvem alguns dos sintomas da influenza que são observados em humanos (8, 12, 14, 16, 19). A neuroinvasividade de um vírus da influenza H5N1 após exposição intranasal também foi relatada em um modelo de furão (23). Portanto, para estudar os efeitos neurológicos a longo prazo da infecção pelo vírus H5N1, nós infectamos furões com vírus H5N1 que causam sintomas leves nesses animais e observamos os efeitos no sistema nervoso central (SNC) por 9 meses. Também procuramos elucidar a rota pela qual estes vírus H5N1 invadiram o SNC.

Furões de seis meses foram inoculados intranasalmente com 106 PFU de A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) ou vírus A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486). Estes vírus foram propagados em células do rim canino Madin-Darby (MDCK) em meio mínimo essencial suplementado com 0,3% de albumina de soro bovino. Nos dias 3, 6, e 12 e meses 1, 3, 6, e 9 pós-infecção (p.i.), colhemos amostras de tecido para isolamento do vírus e exame patológico. Os furões eram letárgicos e apresentavam sinais e sintomas de infecção respiratória durante os primeiros 10 dias a.i., mas não apresentavam sinais neurológicos apreciáveis, o que contrasta com os resultados relatados anteriormente (23). Amostras de tecidos de turbinas nasais, pulmões, traquéia, cérebro, fígado, baço, rins, coração, pâncreas e medula espinhal foram colhidas e homogeneizadas para uma suspensão de 10% com solução salina tampão fosfato. O título do vírus em cada tecido foi determinado por meio de ensaios com placas. Os vírus se replicaram principalmente nas turbinas nasais, com títulos de vírus que alcançaram 105 a 106 PFU/grama de tecido por 3 a 6 dias a.i. (Tabela 1). Os tecidos cerebrais coletados de HK483- ou HK486–furões infectados foram preservados em formalina neutra tamponada a 10% e processados para a incorporação de parafina. Os tecidos embebidos em parafina foram cortados em fatias de 5 mm de espessura e corados com hematoxilina e eosina (H&E). Foram cortados cortes adicionais para coloração imunohistológica com anticorpos policlonais de coelho contra um vírus da gripe H5. O exame histológico revelou invasão ou dano neuronal, incluindo inflamação do plexo coróide (Tabela 2). Furões infectados com o vírus HK486 mostraram evidência de inflamação não supurativa (Fig. 1a) e expressão do antígeno viral (Fig. 1b) que persistiu por 12 dias; antígenos virais não foram detectados com 1 mês a.i. A encefalite não supurativa durou 3 meses (Fig. 1c), com cicatriz residual glial aparente aos 6 e 9 meses a.i. nas áreas onde antígenos virais foram detectados na fase inicial (Fig. 1d). Além disso, furões infectados com HK486 apresentaram lesão macroscópica do sistema olfatório no 12º dia a.i. (Fig. 1e e f). Estes achados sugerem que embora os vírus H5N1 altamente patogênicos afetem principalmente as vias aéreas do hospedeiro (1), eles também podem produzir complicações neurológicas. Em contraste com o vírus HK486, que invadiu o parênquima cerebral dos furões e produziu danos parenquimatosos graves, a segunda linhagem de H5N1, HK483, causou vasculite grave e não supurativa sem danos parenquimatosos aparentes no cérebro dos furões aos 6 dias a.i. Embora o antígeno viral não pudesse ser detectado dentro da vasculatura, a lesão vascular era evidente, caracterizada por inchaço endotelial (Fig. 2a, setas), células apoptóticas dispersas (Fig. 2b, setas), e infiltração intramural de macrófagos (Fig. 2a, setas) e leucócitos polimorfonucleares (Fig. 2b, seta). Lesões vasculares foram encontradas no tálamo, na junção entre a matéria cinzenta e branca e no tronco encefálico. As amostras de cérebro examinadas aos 1 e 6 meses a.i. mostraram lesões hemorrágicas indicativas de hemorragia perivascular crônica e repetida (Fig. 2c) no tálamo, cerebelo e espaço subaracnoideo do cérebro anterior (Fig. 2d). Estas observações são consistentes com relatos de complicações cerebrais hemorrágicas induzidas pelo vírus da gripe durante epidemias anuais (11). A vasculite cerebral secundária à infecção viral é relativamente comum (17) e é provavelmente a causa da fragilidade da parede vascular, levando à hemorragia cerebral. Parece razoável, portanto, concluir que a infecção pelo vírus H5N1 em humanos pode causar hemorragia cerebral semelhante à observada na infecção por outros vírus neurotrópicos.

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Para examinar a rota pela qual os vírus H5N1 invadem o cérebro dos furões, analisamos a distribuição das lesões cerebrais e a expressão do antígeno viral observada nos furões infectados com os vírus HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204), e A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18). Os vírus HK213, VN1204, e NCVD18 foram propagados em células MDCK em meio mínimo essencial suplementado com albumina de soro bovino 0,3%. Furões de seis meses de idade foram inoculados por via intranasal com 106 PFU de vírus. Os tecidos cerebrais foram coletados na fase aguda, com 3 e 6 dias de pós-infecção para VN1204 e NCVD18, e adicionalmente com 12 dias de pós-infecção para HK213. Os tecidos foram processados para coloração de H&E e imuno-histoquímica para exame histológico. As lesões parenquimatosas cerebrais produzidas por VN1204, NCVD18 e HK213 foram caracterizadas por encefalite não supurativa, e o padrão de expressão dos antígenos virais foi essencialmente o mesmo que o de HK486 (dados não mostrados). Para entender a distribuição tridimensional (3D) das lesões cerebrais e antígenos virais, nós os plotamos por imagens 3D (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japão) de um cérebro de mangusto amarelo (Cynictis penicillata), cuja arquitetura se assemelha muito à do cérebro do furão (20). Para visualizar a via olfativa (ou seja, a via sensorial para o olfato), marcamos as vias nervosas desde o bulbo olfativo até o córtex piriforme nas imagens 3D como um quadro de referência (Fig. 3a, amarelo; ver também Movie S1 no material suplementar). Encontramos três padrões distintos de lesões cerebrais, com e sem antígenos virais, causadas pelos diferentes vírus da influenza H5N1: aquelas distribuídas apenas ao longo da via olfativa (Fig. 3b e c, linha amarela tracejada; ver também Filmes S2 e S3) (HK213 e NCVD18); aquelas detectadas ao longo da via olfativa (Fig. 3a, amarelo; ver também Filme S1 no material suplementar). 3d e e, linha amarela tracejada; ver também Filmes S4 e S5) e no tronco cerebral (Fig. 3d e e, setas brancas; ver também Filmes S4 e S5) (HK486 e VN1204); e os de outras áreas (Fig. 3f; ver também Filme S6) (HK483). A base para separar o terceiro grupo de lesões dos outros dois grupos é mais aparente quando as distribuições das lesões são examinadas a posterior (Fig. 3g e h, amarelo versus azul versus vermelho). Estes resultados do mapeamento indicam que a maioria das cepas de H5N1 que testamos invadiram o cérebro pela via olfativa (Fig. 3, linha amarela tracejada). Uma exceção foi a linhagem HK483 (Fig. 3f), que visou claramente a vasculatura cerebral em furões, produzindo lesões fora do sistema olfativo.

Antes dos vírus H5N1 se tornarem pandêmicos, eles provavelmente terão que adquirir a capacidade de crescer bem na porção superior das vias aéreas humanas, o que levaria a uma transmissão eficiente de humano para humano através de espirros e tosse (13, 22). Nossos dados de furões sugerem que se os vírus H5N1 altamente patogênicos ganharem essa base em humanos, eles podem causar complicações neurológicas subclínicas ao invadir o cérebro através das vias nervosas ou ao causar vasculite cerebral. Anteriormente, um vírus H3N2 era detectado em cérebros de furões; entretanto, a quantidade de vírus no cérebro era baixa (menos de 102,2 log10 50% de doses infecciosas de ovos) e nenhuma evidência de antígenos de vírus no cérebro foi relatada (23). Verificamos que o vírus H1N1 pandêmico de 2009 se replicou mais eficientemente nas vias respiratórias dos furões do que um vírus H1N1 sazonal humano (9, 13, 15) e causou lesões olfativas não supurativas no bulbo; entretanto, não encontramos vírus no parênquima cerebral desses animais (dados não mostrados). Portanto, a invasão do parênquima cerebral, como demonstrado pela presença de antígenos virais, é uma característica do vírus H5N1. Portanto, seria pertinente realizar estudos retrospectivos e prospectivos para complicações neurológicas subclínicas em pacientes infectados pelo vírus H5N1. Nossos achados levantam preocupações de que complicações neurológicas subclínicas poderiam acompanhar infecções respiratórias graves na disseminação mundial do vírus H5N1.