Rajskub’s first part was as an Oompa-Loompa in a community theater production of Willy Wonka & the Chocolate Factory, and her first starring role was Raggedy Ann. Em 1996 ela apareceu nos videoclipes das músicas “The Good Life” de Weezer e “The New Pollution” de Beck.
Desde 1996-1998, ela teve um papel recorrente na série da HBO The Larry Sanders Show como assistente de reservas Mary Lou Collins.
O seu papel mais notável é a analista de sistemas da CTU Chloe O’Brian no dia 24, à qual ela se juntou em 2003, no início da terceira temporada do show. Sua personagem foi um sucesso com espectadores e críticos e foi um dos poucos membros do elenco a retornar na quarta temporada do programa. Depois de ser uma estrela convidada regular durante duas temporadas, Rajskub tornou-se um dos principais membros do elenco na quinta temporada do programa. No final da série, ela era a principal fêmea, com a melhor cobrança ficando atrás apenas de Kiefer Sutherland. Sua personagem também teve a honra de dizer as últimas palavras da série na final da temporada 8 da série. Rajskub e Sutherland apareceram brevemente como seus 24 personagens em um episódio de 2007, “24 Minutes”, da série de animação da Fox, The Simpsons. Em agosto de 2013, foi anunciado que ela repetiria seu papel Chloe O’Brian na série limitada de 2014 24: Live Another Day.
Rajskub foi um dos membros do elenco original do Mr. Show. Ela apareceu no The Sketch Show de Kelsey Grammer na Fox Television, The King of Queens como uma personagem chamada Priscilla, e em vários filmes, incluindo Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, vídeos musicais para Beck, Weezer e Sheryl Crow, bem como retratar uma mulher cega no filme Road Trip.
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Rajskub fazia parte de uma dupla de banda desenhada (com Karen Kilgariff) chamada Girls Guitar Club. Em 2006, ela fez uma aparição em “Partings”, a final da 6ª temporada do Gilmore Girls, onde tocou um trobairitz à procura da sua grande chance. (Rajskub tinha aparecido anteriormente em Gilmore Girls como protagonista feminina em A Film by Kirk, um curta-metragem feito pelo personagem Kirk Gleason). Ela se voluntariou como atriz para o Programa Jovens Contadores de Histórias. Ela tem formação como pintora, tendo frequentado o San Francisco Art Institute.
Rajskub foi indicada duas vezes para um Screen Actors Guild Award; uma em 2005, e outra em 2007 para Outstanding Performance by an Ensemble in a Drama Series. Ela foi a protagonista do episódio “Flight of the Conchords” como Karen, uma fanática por Arte Garfunkel. Ela estreou como “Gail the Snail” num episódio de It’s Always Sunny in Philadelphia intitulado “The Gang Gives Frank an Intervention”, e repreendeu o papel na final da nona temporada, “The Gang Squashes Their Beefs”, e na temporada treze, “The Gang Beats Boggs”: Ladies Reboot.” Em 2009, ela também apareceu no filme Julie & Julia como Sarah, uma das amigas íntimas de Julie Powell. Em 2010, Rajskub fez stand-up no Stand Up Show de John Oliver em Nova York. Em junho de 2010, ela apareceu no episódio “Lovesick” durante a segunda temporada da série americana Royal Pains.
De julho a outubro de 2010, ela se apresentou em seu show solo, Mary Lynn Spreads Her Legs, no Steve Allen Theater em Los Angeles. A crítica F. Kathleen Foley do Los Angeles Times escreveu “esse título alegremente vulgar resume o tom geral, que muitas vezes é bruscamente obsceno”. O programa, escrito por Rajskub com a ajuda do diretor / desenvolvedor Amit Itelman, foi inspirado nas experiências de Rajskub com gravidez, parto e maternidade precoce.
Em janeiro de 2011, Rajskub guest-starred no episódio “Our Children, Ourselves” na segunda temporada do ABC’s Modern Family. No outono de 2011, Rajskub apareceu na sitcom de curta duração How to Be a Gentleman. Também em 2011, a série web de Rajskub, Dicki, começou a ser transmitida no My Damn Channel. Dicki é baseado em um número de pessoas que Rajskub cresceu dentro e ao redor de Michigan. A personagem do título é uma mulher de 40 anos que vive em casa com seus pais, faz artesanato e leva sua arte a sério. Dicki tem sido uma das séries da web de maior sucesso do My Damn Channel até hoje. A primeira temporada terminou em novembro de 2011, mas uma segunda temporada está atualmente em desenvolvimento. O Rajskub actuou na edição de Junho de 2012 de Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), um showcase mensal no qual celebridades compartilham histórias verdadeiras que nunca gostariam que suas mães soubessem. Ela atualmente hospeda um podcast na Rede Nerdista chamado Kickin’ it Mary Lynn Style.
Em 2013, Rajskub apareceu na quarta temporada de Desenvolvimento Preso em um papel silencioso mas bem recebido como Heartfire, uma personagem que Rajskub disse “fale do coração, mas não use nenhuma palavra”. No mesmo ano, Rajskub também apareceu na série web All Growz Up with Melinda Hill.
Rajskub apareceu no podcast do Conselheiro de Orientação TV de Ken Reid em 27 de março de 2015.
Em agosto de 2016, Rajskub apareceu no Festival Fringe de Edimburgo em 24 Horas Com Mary Lynn Rajskub e foi bem recebido por fãs e críticos.
Em 2017, Rajskub apareceu na primeira temporada da série Dream Corp LLC do Festival de Edimburgo, interpretando Patient 46 no episódio “Are You Down With OCD?
Em 2018, Rajskub apareceu na Night School em frente a Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe, e Keith David.
Em 2021, Rajskub lançou um especial de comédia de 49 minutos chamado Mary Lynn Rajskub: Ao vivo da Pandemia; pode ser alugado ou comprado através de vários serviços de vídeo-on-demand.