O domínio do ouriço-do-mar é um centro de padrões neurogênicos dependente de Six3 | Desenvolvimento

RESULTADOS

Identificação de candidatos ao domínio do pólo animal (APD) regulatório

Para definir o estado regulatório precoce do APD no embrião de ouriço-do-mar, usamos simultaneamente a bioinformática e abordagens experimentais para identificar genes que codificam proteínas regulatórias que são expressas neste território antes da gastrulação. A abordagem bioinformática explorou os esforços de anotação da sequência genética de nosso laboratório (Burke et al., 2006) e de outros (Howard-Ashby et al.,2006a; Howard-Ashby et al.,2006b; Materna et al.,2006; Tu et al.,2006), que documentaram padrões de expressão da DPA de muitos fatores de transcrição codificadores genéticos e/ou que eram ortologs de fatores de tofunção conhecidos no tecido neural em embriões de outras espécies. A abordagem experimental comparou a representação dos RNAs em Δcadherin mRNA-injectedversus embriões normais na fase de eclosão da blástula. Os embriões sem nuclearβ-catenin consistem quase exclusivamente de ectoderme de pólo animal, como mostram os padrões de expressão de foxq2 e hbn. Em embriões normais, estes mRNAs estão restritos ao pólo animal no estágio de blástula (Burke et al., 2006;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) e os dominios de sua expressão no estágio de mesênquima sobrepõe-se no pólo animal (Fig. 1B-D). Asdevelopment prossegue através da gastrulação, o domínio das células que exprimem a blástula forma um anel que envolve as células que expressamfoxq2 (Fig. 1F). Quando a sinalização Wnt, Nodal e BMPcanonical são eliminadas pela injeção ΔcadherinmRNA, a metade do embrião do animal expressa foxq2 enquanto a maior parte do restante do embrião expressa hbn(Fig. 1H). Estes padrões indicam que embriões sem sinalização canônica Wnt e Nodal-BMP2/4 consistem quase inteiramente de um APD dramaticamente expandido, cujas bordas externas são definidas pela expressão hbn. Foxq2 e hbntranscripts aparecem no APD durante os estágios de clivagem tardia/blástula inicial, indicando que a especificação do APD ocorre pelo menos por esta altura.

Para identificar genes reguladores precoces de APD, comparamos as relativeconcentrações de mRNAs individuais em Δcadherin mRNA- versus embriões injetados por glicerol na fase de eclosão da blástula usando um microarrayrepresentando todas as previsões genéticas encontradas na sequência do genoma do ouriço-do-mar(Wei et al., 2006). Este estagio marca a transição entre a clivagem e o início da morfogênese e é curto após o tempo em que os primeiros marcadores para o APD foram detectados (Burke et al., 2006; Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Tu et al., 2006; Yaguchi et al., 2008). Foi identificado um conjunto de genes que codificam fatores de transcrição e componentes da via de sinalização com uma média de pelo menos três vezes maior de expressão em dois lotes ofΔcadherin. embriões injetados de mRNA foram identificados. Estes foram parcialmente sobrepostos com o conjunto de genes candidatos identificados pela abordagem bioinformática. Os conjuntos combinados contêm 27 genes e constituem um conjunto provisório de genes reguladores de APD (E-APD)(Tabela 1).

Para identificar os genes mais antigos expressos dentro do conjunto E-APD, perfis de expressão temporal gerados por microarray, como descrito anteriormente (Wei et al.., Os padrões foram verificados por comparação com dados publicados (Burke et al., 2006;Croce et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Materna et al., 2006;Sweet et al., 2002;Takacs et al., 2004;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) e por nossas hibridações in situ (nossas observações não publicadas). Os gêneros foram classificados em três grupos: aqueles representados maximamente na população do RNA interno (Fig. 2A), aqueles fortemente upregulados durante os estágios de clivagem (Fig. 2B,C) e aqueles superregulados entre os estágios de clivagem tardia e gastrula precoce (Fig. 2D). Focalizamos primeiramente os membros do grupo de expressão embrionária precoce. Como mostrado abaixo, utilizando ensaios bothloss- e gain-of-function, identificamos um, Sp-Six3(a seguir Six3), que opera no topo ou próximo ao topo da hierarquia geradora da APD.

Six3 é expresso no início da APD

A identificação do ouriço-do-mar six3 é inequívoca porque sua seqüência é muito bem conservada no homeodomínio (98% idêntico aHsSix3), no domínio seis (91%) e no domínio de interação groucho (71%) (verFig. S1 no material suplementar). Confirmamos estudos anteriores mostrando que Six3 é expresso em um padrão dinâmico durante o desenvolvimento do Paracentrotus lividus (Poustka etal., 2007), uma espécie intimamente relacionada ao Strongylocentrotuspurpuratus utilizado neste estudo. As características mais importantes são que as transcrições doSix3 são expressas no hemisfério animal durante a fase de latecleavage (Fig. 3A), na APD pelo estágio de blástula eclodida (Fig.3B) e depois em dois anéis (Fig.3G,H), um próximo à periferia da APD(Fig. 3C-F,H) e o outro no endomesoderm (Fig. 3C-G), durante os estágios de blástula mesênquima. Durante a gastrulação, Six3 é expressa em algumas células secundárias do mesênquima espalhadas pelo blastocoel e na ponta do arcentroon(Fig. 3I, seta), como relatado por Howard-Ashby et al. (Howard-Ashby etal., 2006b), em células do pólo animal(Fig. 3I,J) e ectoderme oral(Fig. 3J,K). No estágio de pluteus,Six3 RNA é detectado em dois grupos de células flanqueando a boca(Fig. 3K, setas) e na faixa de tecilia (Fig. 3K).

Seis níveis globais de mRNA no estágio inicial da blástula de mesênquima não mudam significativamente com a injeção de Δcadherin mRNA(Tabela 1). As hibridizações in situ são consistentes com este resultado e mostram que a distribuição difere em embriões injetados em Δcadherin mRNA, estando ausente das células vegetais e retendo a expressão ampla do hemisfério animal que é estabelecida antes da restrição por processos dependentes do Wnt canônico (ver Fig. S2 no material suplementar).

A função Six3 é necessária para a formação de APD e diferenciação de neurônios

Para testar a função Six3, injetamos em ovos fertilizados morfolinos duplamente fertilizados Six3-translation-blocking morpholinos, cada um dos quais com os mesmos defeitos de desenvolvimento. Os embriões aos 3 dias assumiram uma morfologia arredondada (Fig. 4A,B) e os espículais estavam reduzidos ou ausentes. Ao ectoderme do pólo animal faltava a morfologia espessadaepitelial característica da placa animal(Fig. 4, comparar A,B com C,parênteses). Em alguns lotes de embriões, a gastrulação ocorreu normalmente, embora tardia, e a posição do arcentroon mostrou que a polaridade oral/aboral foi estabelecida (Fig. 4A). Em outros lotes, a maioria dos embriões foi exogastrulada. Inembryos sem Six3, a diferenciação neural foi fortemente inibida, conforme demonstrado pela imunodifusão de marcadores neurais normalmente expressos durante os estágios de lategastrula e pluteo (Fig.4, comparar A,B com C). A maioria (2/3) dos embriões continha neurônios noserotonérgicos e o restante tinha um número reduzido (Fig. 4D) em comparação com o número normal neste estágio (3-5). O mesmo ocorreu com todos os outros neurônios, avaliados pelo marcador pan-neural synaptotagmin (1e11)(Fig. 4A,B), que são encontrados na APD e na banda ciliada de embriões normais de 3 dias(Fig. 4C). Significativamente, a expressão do hbn foi reduzida a um nível indetectável por meio da hibridização in situ (Fig. 4F versusFig. 4E). As medidas de QPCR confirmaram esta observação e mostraram que os níveis de hbn efoxq2 mRNAs, que marcam os limites externos e internos do APD, respectivamente, foram reduzidos de 8 a 10 vezes em Seis3 morfantes no estágio de blastula de temaênquima (Fig. 5).

Six3 é necessário para expressão da maioria dos genes no E-APDset

O fenótipo marcante produzido pela perda de Six3, bem como sua expressão precoce no embrião, sugeriu que ele poderia funcionar perto do topo da rede regulatória do geneAPD. Para examinar essa possibilidade mais a fundo, utilizamos a análise de microarranjo para procurar por genes dependentes de Six3 às 27 horas, os genes do conjunto E-APD aproximam-se dos níveis máximos de expressão. Para eliminar as funções endomeodérmicas do Six3, realizamos esta tela inΔcadherin – embriões injetados. Como mostrado noFig. 5A, a perda de Six3 nestes embriões eliminou completamente o desenvolvimento de todos os neurônios em excesso encontrados no Δcadherin – embriões injetados e nenhum epitélio espessado formado, demonstrando um papel importante para Six3 no desenvolvimento da APD. Os microarraydata identificaram um número surpreendentemente grande de previsões genéticas (682) que foram fortemente desregulamentadas (pelo menos 4 vezes) em embriões duplamente injetados withΔcadherin mRNA e Six3-MO, em comparação com embriões injetados apenas withΔcadherin mRNA. Além disso, mais de 60% de todos os genes na tela de microarranjo anterior que foram upregulados pelo menos 3 vezes inΔcadherin embriões injetados de mRNA, e, portanto, com probabilidade de serem expressos na APD, foram significativamente downregulados pela perda de Six3. Importante, os dados de microarranjo indicaram que a maioria dos genes da DAPE eram sensíveis ao Six3 (Fig. 5B, amarelo). A boa concordância com isto, as medições de QPCR em dois outros lotes de embriões mostraram que apenas 5 genes E-APD não dependiam significativamente de Six3 (Fig. 5B, vermelho, azul).

A sobreexpressão de Six3 é suficiente para expandir o APD

Estes resultados suportam fortemente a ideia de que Six3 funciona cedo nas redes reguladoras do APDgene, e levantam a possibilidade de que ele possa ser suficiente para induzir outras células do embrião a adoptar os destinos do APD.A sobreexpressão de Six3 resultou em embriões com uma extraordinária mudança na morfologia. Uma faixa em forma de ferradura de células densamente empacotadas estendida no sentido longitudinal do pólo animal(Fig. 6, comparando B,C com A). Neurônios serotonérgicos, normalmente restritos à placa animal(Fig. 6D), aumentaram em 4 vezes e foram distribuídos ao longo da faixa densa(Fig. 6G). Além disso, as formas colunares e a disposição das projeções neurais com células insinaptotagmáticas (1e11) são similares às da placa de embriões de controle do animal (Fig. 6E, caixa branca tracejada versus Fig.6H). Todas essas células contêm em seus núcleos NK2.1(Fig. 6J-M, verde), fator atranscrição normalmente expresso na placa animal e ectodermeupra-oral adjacente (Fig.6I,I′; círculos verdes emFig. 6U), assim como algumas células no primeiro plano (Takacs et al.,2004). Uma cadeia de células neuronais 1e11-positivas divide a banda (Fig. 6K, vermelho) e as células do lado do orifício da banda NK2.1-positiva também expressam Gsc (Fig. 6L,N, vermelho). A combinação de NK2.1 e Gsc marca exclusivamente o epitélio facial supra-oral na borda oral da placa do animal (Fig. 6I,I′, células amarelas e Fig. 6U, círculos amarelos). As células colunares da banda expandida, densamente empacotadas, circundam mais células epiteliais achatadas que expressam NK2.1, mas não Gsc(Fig. 6M,N), assim como as células das regiões superiores da boca de embriões normais(Fig. 6I, boca, m). A evidência de que estas células são semelhantes àquelas próximas à boca dos embriões normais é que elas expressam hbn mRNA, que, emembryos normais de 3 dias, se acumula ao redor da margem da placa do animal e se estende até o ectoderma supra-oral (Fig. 1, Fig. 6O). NoSix3-misexpressor de embriões, as células hbn-positivas estão concentradas no epitélio fino do pólo vegetal e, portanto, localizadas na mesma posição relativa à placa animal expandida e às células Nk2.1-positivas no antebraço superior como nos embriões normais (Fig.6P,Q). O lado oposto à região oral se diferencia como epitélio fino, expressa o marcador ectoderma aboral, Spec1(Fig. 6R-T) e pode corresponder à faixa hbn-positiva do ectoderma aboral adjacente à placa do animal. Coletivamente, esses padrões de expressão gênica levam à notável conclusão de que Six3 é suficiente para reespecificar o destino das células na maioria do restante do embrião, gerando um embrião de 3 dias composto por um domínio de pólo animal muito expandido, mas corretamente padronizado, com polaridade oral/aboral. O APD em embriões normais e Six3-misexpressores é marcado pelos círculos azuis na Fig. 6U.

Porque Six3 pode expandir todo o APD e promover o desenvolvimento de neurônios ectópicos, perguntamos quais genes do conjunto de genes E-APD foram superregulados, usando medidas de microarray e QPCR.A Tabela 2 lista 10 desses genes cujos níveis de mRNA são elevados pelo menos 3 vezes em Six3 mRNA-injetados.

Six3 can suppress TGF-β signaling but does not eliminateoral/aboral polarity

Six3 misexpression does not eliminate oral/aboral polarity because oral and andaboral ectoderm markers are expressed on opposite sides of the embryo andneurons normally found in the APD are confined to an intervening band.No entanto, Six3, malexpressa, reduz tanto a expressão nodal quanto a da esquerda e da coordenada, em blastulae mesênquima (Tabela 3, à esquerda), pois Six3 fornece entrada positiva na expressão do FoxQ2, que tem sido mostrado para reprimir a expressão nodal (Yaguchi et al, Surpreendentemente, Six3 não suprime o acúmulo de bmp2/4 mRNA como muchas, pois reduz a expressão nodal, embora a expressão de bmp2/4 requeira função nodal em embriões normais(Duboc et al., 2004). Este paradoxo pode resultar de uma combinação de redução da inibição mediada por coordenadas da sinalização de BMP2/4 associada à difusão do BMP2/4 e posterior ativação, como foi demonstrado em outros sistemas(Biehs et al, 1996;Jones et al., 1992).

Wnt canônico, não TGF-β, os sinais evitam a expansão do APD para o ectoderme lateral

Os sinais que delimitam o APD dependem da sinalização canônica de Wnt, pois sua eliminação permite que o APD englobe quase todo o embrião(Yaguchi et al., 2006)(Fig. 1). Como o Nodal e o BMP dependem dos sinais canônicos de Wnt, eliminamos ambos os ligandos TGF-β com aNodal-MO (Yaguchi et al., 2008) para testar se eles eram responsáveis pela restrição Wnt-dependente da APD. Fig.7B,F mostra que este não é o caso, pois os neurônios serotonérgicos são restritos à APD nestes embriões. Entretanto, quando os morfantes nodais são fornecidos com Seis3 exógenos, então os neurônios serotonérgicos aumentam muito em número e aparecem em toda a metade do embrião animal(Fig. 7D), como é observado inΔcadherin-misexpressores de embriões(Yaguchi et al., 2006), sem sinalização canônica de Wnt. Portanto, a expressão ectópica de Six3 canoverride os outros sinais, presumivelmente Wnt, que restringem esses neurônios aoAPD de embriões normais.

Embora os neurônios serotonérgicos não se formem no ectoderma lateral em Nodalmorphants, alguns neurônios não serotonérgicos o fazem(Fig. 7B). Isto resulta principalmente, se não exclusivamente, da perda da sinalização BMP2/4, pois o mesmo resultado é obtido em embriões injetados com BMP2/4-MO (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.Aand R. D. Burke, inédito). Como o desenvolvimento de todos os neurônios depende de Six3 no embrião normal, perguntamos se os neurônios ectópicos em Nodalmorphants também dependem de Six3 pela co-injeção de Nodal-MO e Six3-MO. Inesperadamente, os neurônios serotonérgicos presentes no pólo animal em Nodalmorphants foram perdidos nos morfantes duplos (Fig. 7G,H). Esses embriões não contêm neurônios não serotonérgicos diferenciados com processos axonais, embora tenham sido observadas algumas manchas 1e11-imunoativas. Estas podem indicar a presença de neurônios incompletamente diferenciados ou refletir um viés neural inicial de células ectodérmicas que normalmente é substituído pelo TGF-βsignaling.

Six3 pode antagonizar a sinalização de Wnt

Os fatos de que a DPA não se expande em morfantes nodais, mas sim em embriões injetados em inΔcadherin e que Six3 pode superar os efeitos dependentes de Wnt canônico no ectoderme lateral aumentam a possibilidade de Six3reprimir a sinalização de Wnt. Em apoio a esta hipótese, descobrimos que Six3misexpression desregulamenta a maioria dos genes que codificam os ligandos de Wnt que são expressos durante o desenvolvimento precoce (Tabela 3, esquerda) (Fig. 8).Um destes é Wnt8, um sinal vegetal crucial necessário para o desenvolvimento endométrico normal (Wikramanayake etal., 2004), um resultado que é consistente com a falta de desenvolvimento vegetal em embriões Six3-misexpressores. Coletivamente, esses resultados sugerem que as fronteiras da DPA são determinadas pelo antagonismo de Six3/Wnt.

Six3 não é suficiente para reprimir a expressão de wnt e nodais na DPA

A capacidade de Six3 de desregular fortemente (direta ou indiretamente) os genes que codificam os ligandos Wnt, assim como os nodais, esquerdinos e coordenados, levanta a possibilidade de que normalmente impede a expressão desses genes na DPA. Para avaliar isso, examinamos primeiramente os efeitos de Six3 na expressão gênica em embriões injetados em Δcadherin, a fim de eliminar possíveis efeitos contra-atuantes da função Six3 no endomeoderme. Ambos os dados de microarranjo e QPCR mostram que, em embriões constituídos principalmente pela APD, Six3suprime a expressão dos genes Wnt, e nodal, esquerda e coordenada (Tabela 3;Fig. 8). Entretanto, em embriões normais (injetados com glicerol), não é possível detectar a repressão desses genes por Seis3 (Tabela 3;Fig. 8), indicando que mecanismos adicionais protegem a DPA da expressão Wnt e TGF-β no embrião normal.

Regulação de Seis3 de outras vias de sinalização

Six3 também regula positivamente (direta ou indiretamente) as proteínas codificadoras de genes que funcionam em outras vias de sinalização(Tabela 3). Estas incluemelta, o Notch ligand que medeia a inibição lateral, um processo crucial no desenvolvimento neural, assim como outros potenciais reguladores do pneumogensis. Estes últimos incluem fgf9/16/20, tipo fgfr, receptor ligado à membrana sem o domínio da tirosina quinase, e frizzled5/8, um receptor Wnt que pode transduzir sinais não canónicos, mas cuja função na DPA é desconhecida (Croce etal., 2006). Estudos futuros examinarão como as atividades destas vias de sinalização e fatores de transcrição precoces dependentes de Six3 interagem na rede regulatória do gene APD.