O fungicida azoxistrobina promove a dominância de cianobactérias de água doce através da alteração da competição

Toxicidade de AZ em algas verdes e cianobactérias

Modelo cyanobacterium M. aeruginosa assim como uma alga verde comum C. pyrenoidosa foram usadas para investigar a toxicidade de AZ em algas verdes e cianobactérias. O crescimento de M. aeruginosa não foi suprimido pela gama de concentrações de AZ durante o tratamento de 7 dias (Fig. 1a), enquanto que o crescimento de C. pyrenoidosa foi inibido em aproximadamente 9,2-30% nas três concentrações de AZ testadas após 7 dias (Fig. 1a). O crescimento de C. pyrenoidosa na presença de uma baixa concentração de AZ (5-10 μg L-1) e com baixa densidade inicial de células algas (cerca de 20.000 células/mL, próximas da densidade de algas na natureza), que são condições representativas de ambientes naturalmente contaminados, foi inibido significativamente em 20~30% (arquivo adicional 1: Figura S2) (p < 0.05), enquanto o crescimento de M. aeruginosa permaneceu inalterado nas mesmas concentrações de AZ testadas. Estudos laboratoriais anteriores também mostraram que os efeitos tóxicos inibidores de AZ variaram dramaticamente entre algas verdes e cianobactérias; por exemplo, a toxicidade do AZ dissolvido no crescimento da clorofita Pseudokirchneriella subcapitata foi quase 500 vezes maior do que a relatada na cianobactéria Anabaena flos-aquae .

Microcosmos foram usados para estudar os efeitos do AZ na comunidade do plâncton. Os microorganismos foram separados da água natural do lago por filtração e transferidos para um meio artificial, após o qual uma gama de concentrações de AZ foi adicionada aos microcosmos. As concentrações de Cl-a e ficocianina foram medidas nos microcosmos após o tratamento com AZ. A concentração de Chl-a, que estima a biomassa total de fitoplâncton, atingiu 4 mg L-1 nos microcosmos de controle após 3 dias de cultivo no meio e ocorreu uma floração de fitoplâncton (Fig. 1b). A exposição à concentração de AZ maior ou igual à menor concentração testada (0,5 mg L-1) durante 3 dias diminuiu a concentração de Chl-a, indicando que o AZ pode ter efeitos tóxicos sobre as populações de fitoplâncton que compreendem as algas verdes (Fig. 1b). A concentração de cl-a diminuiu 8,7% a 37,3% na faixa de concentrações de AZ testadas em microcosmos. Em contraste, a produção de outro pigmento, a ficocianina, que foi usada como um substituto para a biomassa cianobacteriana, aumentou após a exposição de 3 dias em concentrações de AZ maiores ou iguais a 2,5 mg L-1 (Fig. 1b). 1c), sugerindo que AZ favoreceu o crescimento de cianobactérias no microcosmo.

A taxa de decomposição da azoxistrobina no ambiente aquático é estimulada pela luz e AZ tem uma fotólise aquosa DT50 (tempo para 50% de dissipação) (pH 7) entre 8,7 e 13,9 dias . Curiosamente, as concentrações de AZ dissolvidas diminuíram diferentemente com o tempo em resposta a algas verdes e cianobactérias; diminuindo mais rapidamente em culturas de C. pyrenoidosa do que em culturas de M. aeruginosa (Fig. 1d). Isto indicou que a alga eucariótica C. pyrenoidosa absorveu mais AZ dissolvida do que a M. aeruginosa, embora tenham sido inoculadas com a mesma densidade óptica. O esgotamento da concentração de AZ dissolvida nos microcosmos também foi mais rápido que nas culturas de M. aeruginosa (Fig. 1d). O esgotamento de AZ nos microcosmos pode ser explicado pela absorção/adsorção preferencial de AZ nas algas verdes (o componente principal nos microcosmos), bem como pela adsorção de AZ mais elevada em outros microorganismos aquáticos, excepto nas cianobactérias. Os resultados acima sugerem que C. pyrenoidosa foi muito mais sensível a AZ do que M. aeruginosa, provavelmente devido em parte a um maior consumo de AZ (absorção/adsorção) em C. pyrenoidosa.

Variação das proporções de transcrição após exposição AZ em toda a comunidade de plâncton

Sequenciamento transcriptômico de Meta foi realizado para investigar as mudanças na transcrição de toda a comunidade de plâncton após exposição AZ. Um resumo dos resultados do meta-transcriptomic sequencing é fornecido no arquivo Adicional 1: Extended Results (Resultados estendidos). As proporções taxonômicas das transcrições em dois grupos em diferentes níveis taxonômicos são mostradas no arquivo Adicional 2: Dataset 2, que foram representadas pela abundância relativa de transcrições taxonomicamente anotadas (RAT). O valor do RAT não representa a biomassa microbiana, mas sim as mudanças na atividade transcripcional entre as espécies, que representam os estados metabólicos ativos e funções da comunidade microbiana.

A abundância relativa do RAT em microcosmos controle após 7 dias de cultivo foi controlada principalmente por Monoraphidium sp. (gênero Chlorophyta) (Fig. 2). Entretanto, a abundância relativa do RAT de Chlorophyta diminuiu de 63,6% no controle para 35,8% nos microcosmos tratados com AZ (Fig. 2a, arquivo adicional 1: Tabela S2), embora a contagem taxonômica das principais classes dentro do filo Chlorophyta não tenha sido muito afetada pelo tratamento com AZ (Fig. 2c). A abundância relativa de RAT de outras espécies de algas eucarióticas entre as Phaeophyceae e Eustigmatophyceae também diminuiu significativamente nos microcosmos tratados com AZ (p < 0,05), enquanto a abundância de Bacillariophyta aumentou em ~ 6 vezes (arquivo adicional 1: Tabela S2). Enquanto isso, o RAT de Cianobactérias (composto principalmente de Synechococcales) aumentou dramaticamente mais de 20 vezes, ou seja, de 1,7% no grupo controle para 38,3% no grupo AZ. A razão de abundância da sequência de eukaryota/prokaryota diminuiu de 3,1 para 0,9 (Fig. 2b) nos microcosmos tratados com AZ principalmente devido ao aumento drástico de Cianobactérias e à diminuição da Clorofita, respectivamente. O aumento de Cianobactérias nos microcosmos tratados com AZ foi associado a uma maior proporção de Synechococcales e a uma menor proporção de Chroococcales (Fig. 2d), enquanto que AZ não afetou a abundância relativa de ordens dentro da Chlorophyta, a principal divisão eucariótica (Fig. 2c). Cianobactérias dentro da ordem Synechococcale pode formar florações tóxicas, afetando potencialmente os concorrentes das algas eucarióticas .

AZ inibe tanto Monoraphidium sp. como Synechococcus sp. em monoculturas

Como o RAT de Monoraphidium sp. foi reduzido pela metade e o RAT de Synechococcus sp. aumentou acentuadamente após o tratamento AZ, os bioensaios de toxicidade AZ em culturas em laboratório de Synechococcus sp. e Monoraphidium sp. foram realizados para reforçar nossa hipótese de que a adição de AZ nos microcosmos poderia beneficiar preferencialmente uma cianobactéria (Synechococcus sp.) em relação a um concorrente de algas verdes (Monoraphidium sp.). Curiosamente, o crescimento de monoculturas de Synechococcus sp. no meio BG-11 como inibido por ~ 28% após 7 dias (Fig. 3a) (p < 0.05) a uma concentração inicial de AZ de 2.5 mg L-1, embora não tenha sido significativamente influenciado após 4 dias de exposição (p = 0.21), indicando que o crescimento de Synechococcus sp. poderia ser inibido pela exposição de longo prazo a concentrações elevadas de AZ. Em contraste, o crescimento de Monoraphidium em culturas de monoalgal em laboratório foi sempre inibido durante todo o processo de cultivo; com um rendimento celular inibido em ~ 45% após 7 dias de exposição a 2,5 mg L-1 AZ (concentração inicial) (Fig. 3b). Os resultados acima indicam que Monoraphidium sp. é mais sensível ao AZ do que Synechococcus sp. Devido à notável vantagem de crescimento de Synechococcus sp. nos microcosmos tratados com AZ (Fig. 3b). 2d), parece que o AZ tem um papel indireto em beneficiar Synechococcus sp.

AZ inibe Monoraphidium sp. e beneficia Synechococcus sp. em co-culturas

Ao co-cultivar as duas espécies de algas, verificou-se que a adição de AZ beneficia Synechococcus sp. sobre Monoraphidium sp. tanto na água eutrófica filtrada do lago (Fig. 3c-f) como no meio BG-11 modificado (arquivo adicional 1: Figura S3), o que estava de acordo com os resultados do RAT da análise meta-transcriptômica. Após uma cultura de 7 dias em água eutrófica de lago, a razão do número de células (Synechococcus/Monoraphidium) foi aumentada pelo tratamento AZ, de 1,2 no controle para 2,3, 3,6, ou 7,7, para o tratamento com 25 μg L-1, 250 μg L-1, ou 2,5 mg L-1 AZ, respectivamente (Fig. 3c-f). Os resultados do crescimento de algas procarióticas e eucarióticas em meio BG-11 modificado (arquivo adicional 1: Figura S3) foram similares aos da água de lago eutrófico, onde o Synechococcus sp. ganha dominância no tratamento com AZ. Existe um equilíbrio entre algas verdes e cianobactérias na água natural, impulsionado por vários fatores, incluindo interações alelopáticas e feedback positivo. A presença de AZ perturbou este equilíbrio, provavelmente através da alteração do metabolismo das algas verdes, e estimulou o crescimento de Synechococcus sp. em relação ao de Monoraphidium sp. nas co-culturas (Fig. 3c-f). Após o tratamento AZ, o número de células de Synechococcus sp. aumentou para ~ 1,5 vezes em co-cultura (Fig. 3c-f) enquanto o RAT de Synechococcus sp. aumentou mais de 20 vezes em microcosmos em comparação com o controle. Como o RAT não pode ser facilmente comparado à densidade celular, é difícil comparar quantitativamente os experimentos de laboratório e de microcosmo. No entanto, ambos os experimentos sugerem que o AZ favorece o crescimento de cianobactérias através da alteração da competição com algas verdes.

AZ altera a atividade transcripcional de fungos, vírus, bactérias e zooplâncton

O RAT dos fungos, incluindo Zygomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Ascomycota, todos diminuíram significativamente (p < 0,05) após a exposição ao AZ em comparação com o controle (arquivo adicional 1: Tabela S2) devido à ação fungicida do AZ. Vale notar que o RAT do filo Chlorobi, que inclui bactérias fotossintéticas que não produzem oxigênio e preferem ambientes anaeróbicos, também aumentou significativamente (~ 8 vezes) (p < 0,05) nos microcosmos tratados com AZ. Embora a concentração total de oxigênio dissolvido (DO) tenha permanecido super saturada nos microcosmos tratados com AZ, em comparação com o controle (arquivo adicional 1: Figura S4), as microzonas anóxicas ao redor dos agregados microbianos (talvez cianobactérias) podem estar bem desenvolvidas nos microcosmos tratados com AZ, o que estaria de acordo com o aumento do RAT do Clorobi. O RAT do zooplâncton na maioria dos filamentos, tais como Arthropoda, Nematoda e Cnidaria, diminuiu sob exposição AZ em relação ao controle (arquivo adicional 1: Tabela S2), enquanto o inverso foi verdadeiro para alguns gêneros como Acanthamoeba (Tabela 1). Em geral, o RAT de alguns zooplâncton (como Daphnia, de Arthropoda), fungos (pertencentes a Chytridiomycota), bactérias heterotróficas (Cytophaga e Bdellovibrio), e vírus (Podoviridae, Siphoviridae e Myoviridae) diminuiu significativamente (p < 0,05) em microcosmos tratados com AZ em comparação com o controle (Tabela 1, Fig. 4). Os organismos planctônicos acima podem pastar, parasitar ou lyse cyanobacteria e desempenhar papéis no controle de sua abundância e, portanto, podem explicar parcialmente a dominância de cianobactérias na presença de AZ. Outra possibilidade para a diminuição da abundância relativa de zooplâncton é que estas alterações podem reflectir a diminuição de clorofitas comestíveis e aumento de cianobactérias não comestíveis, pois as clorofitas têm a maior sensibilidade a AZ do que as cianobactérias.

Também é sabido que os zoósporos fúngicos desempenham papéis críticos na ligação de cianobactérias não comestíveis e zooplâncton. Arthropoda (cladoceranos ou copépodes) são incapazes de sintetizar os novos esteróis e têm de os encontrar a partir dos seus alimentos. Por exemplo, os zoósporos quítridos são um complemento alimentar essencial para as dáfnias quando se alimentam de cianobactérias filamentosas. Como o fungicida AZ inibiu fortemente os fungos e, portanto, provavelmente reduziu os zoósporos fúngicos (Tabela 1), é possível que o pastoreio de dáfnias em cianobactérias diminua, o que por sua vez contribuiria para diminuir o crescimento de dáfnias (Tabela 1) e aumentar o crescimento de cianobactérias, protegendo assim as cianobactérias de serem pastadas. Nem a comunidade zooplanctônica, nem os vírus e parasitas das cianobactérias eram capazes de controlar a floração de cianobactérias. No entanto, eles podem acrescentar estabilidade ao sistema aquático modificando a estrutura da teia alimentar e podem afectar a comunidade microbiana, bem como potencialmente contribuir para a floração de cianobactérias.

Vias meta-transcriptómicas na eucariotas e bactérias em resposta ao tratamento AZ

Desde que a informação geral da anotação transcriptómica é limitada no género Chlorella e outras Chlorophytes , as análises meta-transcriptómicas de toda a comunidade microbiana foram úteis para compreender melhor as interacções entre os organismos planctónicos e as cianobactérias. Um resumo da anotação funcional é fornecido no arquivo adicional 1: Resultados estendidos, e a variação funcional detalhada é fornecida no arquivo adicional 2: Dataset 3, 4. Distinguimos sequências de eukaryota e bactérias e dissecámo-las ao nível 3 da KEGG (Enciclopédia de Genes e Genomas de Quioto). A Figura 5 mostra as 40 vias mais importantes baseadas na abundância relativa de transcrições (pertencentes a quatro sistemas metabólicos mencionados na secção anterior) em eucariotas e bactérias.

Even, embora a proporção de composição de eukaryota não tenha sido muito afectada por AZ (Ficheiro adicional 1: Figura S5a), as vias de nível 3 do KEGG foram muitas vezes sensivelmente afectadas (Ficheiro adicional 2: Conjunto de dados 4). Como mostrado na Fig. 5a, as vias mais sobre-expressas devido à presença de AZ na eucariota foram a transdução do sinal hormonal da planta, a via de sinalização MAPK, o metabolismo do nitrogênio, a proteólise mediada pela ubiquitina e o metabolismo da glicerofosfolipídeo, e as vias mais subexpressas foram a porfirina e o metabolismo da clorofila, a fosforilação oxidativa e o peroxissoma, indicando que o AZ modula a expressão gênica funcional na eucariota.

Em resposta ao florescimento de cianobactérias, a estrutura da comunidade bacteriana e a relativa abundância de vias metabólicas mudou drasticamente (Fig. 5b e arquivo adicional 1: Figura S5b). Como mostrado na Fig. 5b, as vias estreitamente relacionadas às cianobactérias foram significativamente sobre-expressas (p < 0,05), incluindo a biossíntese carotenóide (+ 1326% em relação ao controle), as proteínas fotossíntese-antena (+ 1305%) e a fotossíntese (+ 758%). Também notamos que muitos caminhos com baixa abundância relativa (< 0,05) relacionados à antibiose, metabolismo de vitaminas e síntese de polissacarídeos foram diferentemente expressos em resposta ao AZ (arquivo adicional 2: Dataset 4). Estas funções são discutidas abaixo.

1. Modulação da fosforilação oxidativa e fotossíntese por AZ. O nível de expressão relativa dos genes relacionados à fosforilação oxidativa tanto na eucariota quanto na procariota diminuiu drasticamente nos microcosmos tratados com AZ, e o grau de inibição nos dois reinos foi equivalente, ou seja, ~ 42% em comparação com o controle. Genes (atpA, atpB, atpD, e atpF) codificação para a enzima F-ATPase, nas membranas mitocondrial e cloroplástica, foram significativamente subexpressos tanto na eucariotas como nas bactérias (diminuíram em cerca de 40~80%) (p < 0.05). Esta diminuição na transcrição F-ATPase poderia ser explicada pela ação tóxica do AZ, que inibe o complexo de transferência de elétrons entre o citocromo b e o citocromo c1, diminuindo a respiração mitocondrial e a produção de ATP. Em relação às vias metabólicas fotossintéticas, a modulação das transcrições do fotossistema após o tratamento com AZ foi diferente entre eukaryota e bactérias (arquivo adicional 1: Figura S6). Nas bactérias, os genes envolvidos no fcobilisoma (por exemplo, apcD, apcE, cpeC, cpeZ) foram fortemente sobre-expressos (por cerca de 4-32 vezes), enquanto na eukaryota, a transcrição dos genes que codificam as proteínas do complexo de colheita de luz (por exemplo, LHCB2 e LHCA1) permaneceu praticamente inalterada (arquivo adicional 2: Dataset 5). Isto está de acordo com o aumento de cianobactérias nos microcosmos tratados com AZ. Vale ressaltar, entretanto, que as bactérias podem ter mecanismos de desintoxicação AZ para diminuir a toxicidade AZ por um forte aumento (cerca de 10-24 vezes) dos genes da NAD(P)H-quinone oxidoreductase (ndhD, ndhF, ndhH), que codificam uma enzima que protege as células contra o estresse ambiental que pode ocorrer na presença de AZ. Além disso, os procariotas podem desintoxicar espécies reativas de oxigênio através de uma biossíntese carotenóide aumentada (+ 1326%) e do metabolismo do glutatião (+ 344%) e melhorar a reparação celular (genes envolvidos no reparo da incompatibilidade, + 211%) .

2. Síntese e degradação de polissacarídeos. Transcrição de vários genes relacionados à biossíntese de polissacarídeos em eucariotas aumentou (arquivo adicional 1: Tabela S3), por exemplo, genes nas vias de biossíntese de lipopolissacarídeos (+353%). Um sistema associado a polissacarídeos (ABC transportador, +162%) também foi superexpresso tanto no grupo AZ quanto no grupo controle, o que se mostrou exportar polissacarídeos fora das células. A síntese aperfeiçoada de polissacarídeos no fitoplâncton tem sido relatada em ambientes estressantes. Em contraste, em bactérias, 4 vias (biossíntese de N-glicanos, vários tipos de biossíntese de N-glicanos, biossíntese de lipopolissacarídeos e biossíntese de peptidoglicanos) relacionadas à síntese de glicosídeos foram subexpressas (em cerca de 63~77%) significativamente (p < 0,05), mas a via “outra degradação de glicosídeos” foi superexpressa por ~ 10 vezes nos microcosmos tratados com AZ, em comparação com o controle. Assumindo que a diminuição generalizada prevista na síntese de polissacarídeos em procariotas ocorreu em cianobactérias, uma suposta diminuição no lastro de polissacarídeos em cianobactérias poderia ajudar a manter as cianobactérias na superfície do lago e ajudar a explorar a luz, que é fortemente atenuada com a profundidade durante a floração. Várias cianobactérias, incluindo as do gênero Synecocchococus, mostraram de fato modular a flutuabilidade através da síntese de polissacarídeos .

3. Modulação da biossíntese de vitaminas e potenciais interações entre bactérias e eucariotas. Na eucariotas, todas as vias relacionadas à biossíntese da vitamina B (por exemplo, tiamina, riboflavina, niacinamida, pantotenato, vitamina B6, biotina, ácido lipóico e folato) foram super-expressas (em 14~243%) nos microcosmos tratados com AZ em comparação com o controle (arquivo adicional 1: Tabela S4). Por outro lado, nas bactérias, as vias bioquímicas relacionadas ao folato, nicotinamida e biossíntese de tiamina foram superexpressas (37~139%) após a exposição AZ em microcosmos, enquanto as vias bioquímicas de vitaminas em menor abundância relativa (i.e., em relação aos microcosmos tratados com AZ) foram superexpressas (por 14~243%), biotina e ácido lipóico, riboflavina, B6) foram significativamente subexpressos (em 22~68%, p < 0,05) nos microcosmos tratados com AZ em comparação com o controle (arquivo adicional 1: Tabela S4). Curiosamente, nas bactérias, a abundância relativa de dois genes envolvidos no transporte da vitamina B12 (cobalamina) (isto é, btuB ou K16092: transportador de vitamina B12 e btuF ou K06858: proteína de ligação ao substrato do sistema de transporte da vitamina B12) diminuiu 88% e 57%, respectivamente, nos microcosmos tratados com AZ em relação ao controle (ver arquivo adicional 2: Dataset 5). Como várias espécies eucarióticas (incluindo fungos e muitas clorofitas) não conseguem sintetizar a cobalamina de novo e dependem de bactérias mutualistas para adquirir essa vitamina, nossos resultados suportam a hipótese de que o aumento de cianobactérias na presença de AZ pode ser, pelo menos em parte, explicado por uma diminuição na troca mutualista de vitamina B12 entre bactérias e eucariotas.

AZ mudou as interações entre fungos, algas eucarióticas e cianobactérias

Nossos resultados são consistentes com interações alelopáticas entre fungos ou eucariotas e procariotas com potenciais implicações na dinâmica da floração de cianobactérias. Em primeiro lugar, nossa relatada diminuição na atividade relativa de muitos fungos, que produz vários metabólitos secundários promovendo lise celular de cianobactérias, pode ajudar a favorecer as cianobactérias. Segundo, duas vias eucarióticas de biossíntese antibiótica (biossíntese monobactam (+ 1524%) e biossíntese penicilina e cefalosporina (+ 161%), foram expressas preferencialmente por 1,6 a 15 vezes sob exposição AZ. Isto sugere que os microorganismos eucarióticos poderiam responder ao aumento de cianobactérias pela produção de compostos antibacterianos, embora seja improvável que isto previna surtos de florescimento de cianobactérias. Terceiro, como mostrado no arquivo adicional 1: Figura S7, a abundância relativa de cianobactérias na comunidade bacteriana foi de 39,3% em nosso local de amostragem do Lago Taihu (derivada de dados de seqüenciamento do gene 16S rRNA), enquanto o RAT de cianobactérias nas bactérias após a cultura 7d nos grupos controle e AZ foi de 7,1% e 72,1%, respectivamente. Indicou que a grande proporção de algas verdes (Fig. 3c) poderia limitar a atividade das cianobactérias, mesmo sob condições eutróficas.

Impacto potencial a longo prazo da contaminação por AZ a curto prazo

Como mostrado no arquivo adicional 1: Figura S8, depois de 50 dias de cultivo, as algas e a matéria orgânica se estabeleceram nos microcosmos, tornando-as claras no grupo de controle. No entanto, o grupo AZ ainda apresentava as características típicas de uma floração de algas, parecendo verdes e turvas. Este interessante fenômeno ilustrou que, embora a concentração de AZ estivesse abaixo dos limites de detecção após 15 dias nos microcosmos (Fig. 1d), a alta variabilidade no estágio primário ainda causa influência duradoura até 50 dias (arquivo adicional 1: Figura S8). Os resíduos de AZ foram amplamente detectados em ambiente aquático , indicando que estes corpos de água podem ter sofrido uma vez em uma contaminação de AZ de alta concentração a curto prazo. O AZ dissolvido diminuiu rapidamente nos microcosmos (Fig. 1d), caindo abaixo do limite de detecção após 15 dias de cultura de algas, o que indicou que o AZ dissolvido foi dissipado rapidamente nos microcosmos. Em sistemas de água natural, o AZ pode ser absorvido pelo plâncton, adsorvido em superfícies orgânicas e sedimentos, ou ser dissipado através da biodegradação e fotólise. Portanto, espera-se que o pico de concentração de AZ seja muito maior do que as concentrações dissolvidas detectadas em lagos, riachos ou águas subterrâneas de 0,01 a 29,70 μg L-1 , sugerindo que concentrações de fungicidas próximas às usadas em nossos experimentos podem muito bem ocorrer transientemente, o que causaria efeitos negativos a longo prazo. Por exemplo, os resíduos do fungicida Thiram® poderiam ser detectados na faixa de 0,27-2,52 mg L-1 da água superficial ao redor das parcelas aplicadas. Além disso, vários outros fungicidas que podem interagir com AZ existem em sistemas aquáticos (frequentemente adsorvidos aos sedimentos) e podem ser libertados de volta para a água superficial através da remobilização dos sedimentos . Segue-se que concentrações elevadas de AZ nos ambientes (pelo menos esporadicamente) podem induzir efeitos tóxicos nos microrganismos aquáticos, enquanto paradoxalmente, favorecem o crescimento de cianobactérias.

Contaminação por fungicidas sempre coexiste com o sobre-enriquecimento de nutrientes em corpos de água próximos a regiões agrícolas, onde florescem frequentemente cianobactérias. Podemos presumir que a eutrofização e o contaminante AZ ocorreriam simultaneamente em uma área limitada de água próxima a áreas de cultivo após a chuva, o que causaria mudanças dramáticas na estrutura da comunidade microbiana e promoveria o florescimento de cianobactérias. Estas cianobactérias podem ser transferidas para outros corpos de água após as chuvas seguintes. Elas irão então mudar a estrutura da comunidade de águas contaminadas e contribuir para a eutrofização das águas próximas. Sabe-se que a rede ecológica microbiana tem o seu próprio equilíbrio, que pode ser alterado pela eutrofização. Este estudo indica que os fungicidas podem desempenhar um papel importante na promoção dos HCBs através de interacções complexas de redes comunitárias.