O papel anti-catabólico da lactoferricina bovina na cartilagem

Lactoferricina bovina (LfcinB) é um peptídeo multifuncional derivado da lactoferrina bovina que demonstra atividades antibacterianas, antifúngicas, antivirais, antitumorais e imunomoduladoras. Recentemente, estudos têm focado o potencial anti-catabólico e anti-inflamatório da LfcinB. A LfcinB é capaz de modular os efeitos de citocinas como a IL-1 e o fator de crescimento fibroblasto 2, assim como promover fatores anabolizantes específicos da cartilagem. Estas propriedades são particularmente importantes na manutenção da homeostase da cartilagem e na prevenção de um estado catabólico, o que leva à patologia clínica. Esta revisão centra-se na literatura recente elucidando o papel da LfcinB na prevenção da degradação da cartilagem.

Introdução

Doenças degenerativas da cartilagem como a osteoartrite (OA) nas articulações e a doença degenerativa discal (DDD) na coluna vertebral são doenças prevalentes que conferem um impacto significativo na sociedade actual. A OA é a principal causa de incapacidade entre a população idosa (1), e a DDD contribui para a natureza debilitante das dores crónicas das costas (2-4). Actualmente, a patogénese destas duas condições é largamente desconhecida, mas ambas envolvem a progressiva deterioração e degradação do tecido cartilagíneo. A literatura recente tem-se concentrado na compreensão de muitos dos processos fisiopatológicos envolvidos na degradação das cartilagens, com a intenção de desenvolver novas terapias destinadas a retardar e/ou reverter estas doenças.

Em condições normais, tanto os condrócitos articulares como as células do disco intervertebral (DDD) mantêm um equilíbrio dinâmico entre a síntese e a decomposição dos componentes da matriz extracelular (ECM) (5, 6). Em estados degenerativos, há uma ruptura do equilíbrio da matriz, levando à perda progressiva do tecido cartilagíneo, supressão da produção de proteoglicanos (PG), e expansão clonal das células nas regiões depletoras. O metabolismo condrócito é desequilibrado devido à produção excessiva de mediadores catabólicos, incluindo metaloproteases matriciais (MMPs), agreganases (ADAMTS), e outras citocinas e fatores de crescimento liberados pelos condrócitos que auxiliam na destruição do ECM (7-9). Portanto, identificar novos fatores de crescimento ou mediadores que suprimam bioquimicamente as vias catabólicas e/ou anti-anabólicas envolvidas na degradação da cartilagem pode deslocar a homeostase para um estado pró-anabólico, servindo potencialmente como uma estratégia terapêutica para retardar tanto a OA quanto a DDD.

Interessantemente, vários estudos recentes revelaram o potencial da glicoproteína lactoferricina bovina (LfcinB), e sua precursora lactoferrina bovina (bLf), para induzir efeitos anti-catabólicos, pró-anabólicos e anti-inflamatórios na cartilagem. Identificada pela primeira vez no leite bovino em 1939 (10), a bLf é uma glicoproteína 80-kDa encontrada em secreções mucosas, fluidos sinoviais, plasma e grânulos neutrófilos (11) e desempenha um papel fundamental em várias vias antibacterianas, antivirais, anticarcinogênicas e antiinflamatórias (12). Recentemente, descobriu-se que a bLF fornece valor terapêutico nas etiologias músculo-esqueléticas. Por exemplo, a administração oral de bLF em um modelo de artrite adjuvante de rato suprimiu o desenvolvimento de artrite e hiperalgesia (13), sugerindo suas propriedades anti-catabólicas e antiinflamatórias em articulações sinoviais. Estes resultados são corroborados por outros achados nos quais injeções periarticulares de LF humana suprimiram a inflamação local em um modelo de artrite séptica murina (14).

LfcinB é formada por clivagem mediada por pepsina da glicoproteína bLf, um membro chave da família da transferrina. A LfcinB foi recuperada do conteúdo gástrico ácido de humanos após a digestão de bLf (15). Similar ao bLF, o LfcinB exerce uma variedade de efeitos em vários tecidos e organismos diferentes. Os efeitos antibacterianos da LfcinB já foram bem documentados. Quando liberado de sua proteína-mãe, LfcinB se transforma de uma estrutura helicoidal α para uma estrutura anfíbia β-hairpin, permitindo que o peptídeo se ligue às membranas bacterianas com alta afinidade (16). Uma vez ligado, o LfcinB aumenta a permeabilidade da membrana celular, provocando assim um efeito bactericida (17). Estudos em outros sistemas biológicos também revelam efeitos antifúngicos, antiparasitários, antivirais, antitumorais e imunomoduladores mediados por LfcinB (17-19), muito parecidos com o bLf. Devido às suas semelhanças estruturais, esses achados sugerem que é muito provavelmente o N-termino hidrofóbico básico do bLf (que contém os resíduos de LfcinB) que responde por esses efeitos compartilhados (20).

Esta revisão irá focar nos poderosos efeitos anti-catabólicos e anti-inflamatórios da LfcinB tanto na cartilagem articular como na DVD, que destacam seu potencial como agente terapêutico para OA e DDD no futuro.

Lactoferricina na cartilagem articular

A homeostase da cartilagem é mantida por um delicado equilíbrio entre as vias catabólica e anabólica. Quando este equilíbrio é perturbado, as vias catabólicas frequentemente predominam e induzem a degeneração da cartilagem, manifestada clinicamente como OA. O efeito da LfcinB nas vias catabólicas associadas à degradação da cartilagem foi primeiramente investigado por Yan et al. (21). Em seu estudo, cartilagem articular humana e sinovium foram cultivadas com IL-1β e fator de crescimento fibroblasto 2 (FGF-2) (duas moléculas conhecidas por conduzir catabolismo na cartilagem articular), com ou sem LfcinB. Elas demonstraram que o LfcinB inibe potentemente os efeitos catabólicos da IL-1β e do FGF-2. Em particular, em condrócitos articulares humanos e fibroblastos sinoviais tratados com IL-1β e FGF-2, a expressão de enzimas degradantes da matriz (ou seja, MMP-1, MMP-3 e MMP-13) e ADAMTSs (ou seja, ADAMTS4 e ADAMTS5) foram desregulamentados tanto nos níveis de mRNA quanto de proteína na presença de LfcinB. Este achado é significativo, pois ficou demonstrado que os MMPs e ADAMTSs contribuem para a degradação das cartilagens (22), e encontrar formas de diminuir suas atividades tem sido o foco de múltiplos estudos (23, 24).

Yan e colegas também elucidaram que a LfcinB pode interferir nas atividades catabólicas do FGF-2 (também conhecido como FGF básico) ao se ligar potencialmente a proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs) como o syndecan 4 (21). O Syndecan 4 facilitou a ligação do FGF-2 ao receptor FGF na superfície da célula. A capacidade do LfcinB de se ligar ao syndecan já foi descrita anteriormente. Mader et al. (25) descobriram que o LfcinB se liga com a sindecan, impedindo a ligação do FGF-2 e do fator de crescimento endotelial vascular (VGEF) em células endoteliais das veias umbilicais humanas e de camundongos. Propõe-se um mecanismo semelhante nas células da cartilagem articular (21). O LfcinB liga competitivamente o sindecan e impede a ligação do FGF-2 ao seu receptor de células articulares, impedindo assim as suas cascatas de sinalização catabólica e/ou anti-anabólica a jusante (21).

Ainda à supressão dos mediadores catabólicos, o LfcinB também inibe os mediadores inflamatórios na cartilagem articular (21). Na cartilagem articular, a LfcinB diminuiu a expressão de vários genes pró-inflamatórios, como a IL-6 e o receptor 2 de toll-like (TLR-2). A IL-6 pode incitar a degeneração da cartilagem através de mecanismos autocrinos e parácrinos, e a TLR-2 incita uma resposta imunológica inata e inflamação nas articulações OA (26, 27). Além disso, a LfcinB também pode conter citocinas antiinflamatórias upreguladas, incluindo IL-4 e IL-10 (21). Ao modular simultaneamente as atividades pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, a LfcinB causou uma redução geral da inflamação no AO.

Num estudo de acompanhamento, Yan et al. (28) caracterizaram ainda as vias de sinalização utilizadas pela LfcinB e descobriram mais um mediador anti-catabólico upregulado na presença de LfcinB (28), inibidor tecidual da metaloproteinase 3 (TIMP-3). Este achado é significativo, pois o TIMP-3, ao contrário dos outros membros da família TIMP (TIMP-1-4), é um potente inibidor com um espectro de substrato relevante na biologia das cartilagens, incluindo MT-MMPs, ADAMTS4, ADAMTS5 e fator de necrose tumoral convertase (29, 30). Dado que o TIMP-3 é o único inibidor endógeno dos ADAMTS (31), isto pode explicar porque a LfcinB foi capaz de bloquear a depleção do PG pela IL-1β e FGF-2 ex vivo (19).

Embora muitas das vias de sinalização a jusante mediadas pela LfcinB permaneçam em grande parte desconhecidas, estudos recentes começaram a descobrir cascatas específicas estimuladas pela LfcinB na cartilagem articular humana. Ao inibir farmacologicamente as vias ERK, Akt, e p38, Yan et al. (28) determinaram que a via ERK-1/2 mediou a maioria dos aspectos dos efeitos da LfcinB nos condrócitos articulares. Além disso, estudos mecanicistas sobre a transcrição de TIMP-3 induzida por LfcinB revelaram um papel essencial do fator de transcrição Sp1 (32, 33). Sp1 pertence ao mecanismo transcripcional do núcleo durante a indução do TIMP-3 porque derrubar Sp1 abafa a expressão do TIMP-3 induzido por LfcinB (32). Curiosamente, Sp1 também foi fundamental para a produção do TGF-β-mediated TIMP-3 (33), sugerindo que este programa transcripcional pode ser ativado por diferentes entradas de sinalização.

Num estudo ainda não publicado, Yan et al. demonstram ainda que a citocina anti-inflamatória IL-11 foi dramaticamente upregulada pela LfcinB. Este aumento da IL-11 foi resultado da ativação da via ERK-1/2, que posteriormente ativou o heterodímero c-Fos/JunD para iniciar a transcrição. A IL-11 induzida então estimulou cascatas anti-inflamatórias e anti-catabólicas através da indução do TIMP-1 de forma Stat3-dependente.

Baseado nestes estudos, nós supomos que a LfcinB promove atividades anti-inflamatórias e anti-catabólicas através de três mecanismos (Figura 1): (i) ligação competitiva da LfcinB aos HSPGs, impedindo assim a sinalização eficiente da IL-1 e FGF-2; (ii) indução do TIMP-3 para limitar as atividades proteolíticas endógenas; e (iii) indução de citocinas protetoras, particularmente a IL-11, que promovem a anti-inflamação e o anti-catabolismo. Embora esses estudos tenham fornecido a base para a compreensão do papel da LfcinB na cartilagem articular, estudos adicionais são necessários para dissecar as vias exatas e genes alvo regulados pela LfcinB.

Lactoferricina em células da DVI

Outra área onde a LfcinB tem mostrado grande promessa como uma opção terapêutica potencial tem sido a degeneração do núcleo pulposo (NP) da DVI. Assim como a cartilagem articular, a manutenção da homeostase do tecido NP baseia-se no equilíbrio entre os processos anabólicos e catabólicos. Quando esse equilíbrio é alterado, a degeneração da DVI é iniciada, culminando potencialmente em dor crônica nas costas do paciente.

Kim et al. (34) examinaram os efeitos da LfcinB sobre a DVI de tecido bovino e humano. Eles demonstraram que a adição de LfcinB a uma cultura de células NP levou a um aumento na síntese de PG. Um mecanismo pelo qual a LfcinB aumentou a síntese de PG foi através da upregulação da SOX-9. A SOX-9 é um fator chave de transcrição que demonstrou aumentar a expressão de agregação e colágeno tipo II em células NP bovinas (35, 36). As células cultivadas com LfcinB têm concentrações quase 2,5-3,0 vezes maiores de SOX-9, dependendo da dose de LfcinB em comparação com aquelas sem LfcinB, demonstrando sua capacidade de promover vias anabolizantes no tecido NP bovino (34). Além da promoção da SOX-9, há evidências de supressão das principais enzimas de degradação da cartilagem, incluindo MMP-1, MMP-13, e ADAMTS5. Esta supressão foi complementada com a promoção de múltiplas TIMPs incluindo TIMP-1, TIMP-2, e TIMP-3, solidificando ainda mais o papel anticatabólico da LfcinB (34). Finalmente, as vias de sinalização pelas quais a LfcinB exerce seus efeitos anabolizantes foram elucidadas. A ativação dos subgrupos de proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) (ERK, p38 e JNK) foi avaliada, e apenas as vias ERK e p38 são ativadas pela presença de LfcinB, enquanto a via JNK não foi ativada em nenhum momento (34). A extensão do envolvimento de cada via ativada foi avaliada por meio de inibidores farmacológicos específicos. A inibição da via do p38 leva a uma diminuição significativa da indução gênica agregada para abaixo do nível do grupo controle. A inibição da via ERK também levou a uma diminuição na indução do agregado, mas não à extensão da inibição do p38 (34).

Ellman et al. (37) investigaram ainda a via de sinalização pela qual a LfcinB atua e identificaram uma relação sinérgica entre a LfcinB e outro mediador anabólico: a proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7). Em seu estudo, o tratamento das células DVI bovinas com a combinação de LfcinB e BMP-7 levou a um maior aumento no acúmulo e síntese de PG, bem como a indução gênica agregada. Eles propuseram que o mecanismo sinérgico foi resultado da ativação compartilhada da SMAD-1/5/8 tanto pela BMP-7 quanto pela LfcinB (38, 39). Além disso, o LfcinB baixou o SMAD-6 (um potente inibidor do SMAD-1/5/8), bem como o Noggin (um inibidor do BMP-7) (37). A diminuição desses fatores inibitórios permite que o LfcinB elimine o feedback negativo do BMP-7 e permita a máxima contribuição anabólica do BMP-7. Os autores concluíram que essa combinação poderia potencialmente ser utilizada clinicamente na prevenção e tratamento da degeneração da DVI (37).

Outra visão da natureza antiinflamatória da LfcinB na DVI é fornecida por um estudo de acompanhamento de Kim et al. (40). Este estudo focou principalmente a interação da LfcinB com os mediadores inflamatórios IL-1 e lipopolissacarídeo de endotoxina (LPS). Tanto a IL-1 quanto o LPS demonstraram ser poderosos mediadores inflamatórios que levam à degeneração de células DVI (41, 42). Através de seus experimentos, Kim et al. (40) demonstraram que a LfcinB induz um aumento na formação da matriz pericelular quando adicionada a culturas de DVI bovina. Esse efeito anabólico foi tão potente que a adição de LfcinB resgatou a formação da matriz pericelular suprimida na presença de IL-1 e LPS. A adição de LfcinB também suprimiu a produção mediada por IL-1 e LPS de MMP-1, MMP-3, MMP-13 e ADAMTS-5, que demonstraram estar envolvidas na degeneração discal. Finalmente, a adição de LfcinB a culturas IVD contendo IL-1 e LPS levou à atenuação da upregulação de TLR-2 e TLR-4. TLR-2 e TLR-4 têm importantes funções reguladoras nas vias inflamatórias e oxidativas que levam à degeneração da DVI (27, 43). A capacidade de suprimir a expressão dos TLRs, bem como de outros mediadores catabólicos, demonstra o potencial anti-catabólico potente da LfcinB na DVI.

Kim et al. (40) também investigaram o potencial terapêutico da LfcinB através do exame de culturas de órgãos ex vivo de coelhos e camundongos brancos da Nova Zelândia. Antes da cultura, os discos foram injetados em bloco com LfcinB (200 μg por disco de coelho e 100 μg por disco de rato). O LfcinB e os discos de controle sem injeções de LfcinB foram cultivados em meio contendo IL-1, LPS, ou nenhum dos dois. Os discos sem a injeção de LfcinB tiveram significativa diminuição do PG na presença de IL-1 e LPS, assim como diminuição da celularidade na matriz pericelular. Os discos injetados de LfcinB demonstraram uma atenuação do efeito da IL-1 e LPS. Este achado é significativo na demonstração do potencial da LfcinB como agente terapêutico contra os ativados catabólicos da IL-1 e LPS na DVI.

Conclusão

Lactoferricina é uma molécula que tem demonstrado ter múltiplas funções em vários sistemas biológicos. O seu papel no sistema músculo-esquelético está apenas a começar a ser elucidado. Em particular, as propriedades anti-inflamatórias e anti-catabólicas da LfcinB fazem dela uma opção atractiva no tratamento da degeneração DDD e IVD. Ambos os processos patológicos são o resultado de potentes mediadores inflamatórios e catabólicos que deslocam o equilíbrio homeostático em direção ao catabolismo. Estudos adicionais são necessários para elucidar os mecanismos e caminhos exatos ativados pela LfcinB; entretanto, o potencial da LfcinB como opção terapêutica em AO e DDD mostra grande promessa.

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