Revisão histórica
Apeso de anormalidades axonais traumaticamente induzidas na maioria dos modelos experimentais de lesão craniana romba, sem ruptura da mielina ou dano franco aos processos neural ou glial adjacentes, não forneceram evidências de ruptura ou tosquia direta dos axônios após a lesão traumática.910 Isto foi apoiado por estudos de fratura por congelamento, realizados nas fases iniciais da lesão axonal, que falharam em mostrar ou a ruptura imediata da mielina internodal ou a perda precoce das junções glial-axonais, sugerindo que a bainha de mielina em si não é imediatamente danificada pelas forças da lesão.23 Nesta fase, ambos os grupos acima postularam que as forças da lesão traumática agem primeiro sobre o axolemma ou o axoplasma enquanto poupam a bainha de mielina. Dentro desta hipótese, as forças mecânicas da lesão poderiam esticar ou ferir o axolemma até seus limites biomecânicos, quando a homeostase iônica falharia e iniciaria uma mudança axonal reativa.
No entanto, em uma série de investigações subseqüentes sobre tecido cerebral tanto de humanos1222 quanto de animais2124 , Povlishock e colegas forneceram dados para apoiar um papel inicial para o citoesqueleto intra-axonal. Seus estudos revelaram uma seqüência complexa de eventos intra-axonais que progrediram para uma mudança axonal reativa. Especificamente, usando anticorpos direcionados ao componente neurofilamento do citoesqueleto, descobriram que houve acúmulo focal da subunidade 68 kDa (NF-L) dentro de uma hora da lesão e esse aumento foi dramático em duas horas. Com o tempo crescente os neurofilamentos se desorganizaram e se desalinharam em relação ao eixo longitudinal do axônio. Não houve perda ou dissolução dos neurofilamentos detectados. Estes dados foram, portanto, inconsistentes com a degradação neutra mediada pela protease do citoesqueleto. Ao invés disso, o aumento da subunidade de neurofilamento 68kDa suportou a possibilidade de um rearranjo traumaticamente induzido do pool de neurofilamentos. Além disso, nenhuma evidência ultra-estrutural de ruptura direta do axolemmal foi detectada nesta série de experimentos. A inflexão e distensão do axolema foi encontrada e atribuída à mudança axonal reativa em curso. Esses achados sugeriram que um efeito mecânico direto sobre o citoesqueleto do cilindro axonal foi o evento central na patogênese inicial da lesão axonal.
Outras abordagens sugeriram que o axolemma estava envolvido no início da mudança axonal reativa. Maxwell et al utilizaram um modelo de tração nervosa para analisar as alterações morfológicas dentro dos axônios danificados.18 Esses autores forneceram evidências de que os locais iniciais de lesão, após um estiramento sem interrupção, são os nós de Ranvier, alguns dos quais desenvolvem “bolhas nodais”. Essas bolhas são protuberâncias do axolemma limitadas ao espaço perinodal e são mais numerosas em 15 minutos após a lesão, mas menos em intervalos posteriores. Nos axônios danificados com bolhas nodais os neurofilamentos foram desorganizados, desviados do eixo longitudinal do axônio e estendidos para dentro das bolhas. Em contraste, as microtubículas mantiveram a sua disposição longitudinal e não se desviaram para dentro da bolha. A análise quantitativa deste material mostrou que houve uma perda significativa de microtubos e um aumento do espaçamento dos neurofilamentos no axoplasma dos nódulos com bolhas nodais associadas. Essa perda de microtubos poderia interromper o rápido transporte axoplásmico resultando no acúmulo focal de organelas membranosas em regiões paranodais adjacentes do axônio para formar tumefacções axonais. Além disso, esses trabalhadores forneceram as primeiras evidências citoquímicas para apoiar a idéia de influxo de cálcio nas fibras nervosas mielinadas lesadas por estiramento.25 O uso da técnica de oxalato-piroantimonato para a localização do cálcio mostrou um aumento do conteúdo de piroantimonato precipitado dentro das bolhas nodais aos 15 minutos após a lesão por estiramento. Isso se correlacionou com uma redução na rotulagem da atividade da bomba de membrana Ca2+ATPase no axolemma nodal.26 O nó de Ranvier é a região especializada do axolemma na qual grupos de canais de Na+, bombas acionadas por ATPase para cálcio e um trocador de Na+/Ca2+ são localizados.2027 Portanto, a perda da atividade da bomba de membrana no axolemma nodal pode fornecer um mecanismo para o influxo de cálcio livre nos nós de Ranvier após lesão traumática. Esta evidência suporta a hipótese de que as forças da lesão traumática resultam em uma pertubação focal do axolemma com o resultante influxo de cálcio livre capaz de ativar uma subpopulação de proteases neutras.25
As investigações biofísicas têm utilizado novas técnicas para analisar o axolemma em condições experimentais analágicas à lesão axonal. Após leve lesão de estiramento, uma série de constrições e expansões ocorre nas fibras nervosas ciáticas do rato adulto. Esta mudança de forma é conhecida como beading.28-30 A transformação da forma essencialmente cilíndrica da fibra nervosa normal para uma que é beaded ocorre rapidamente, dentro de 10 a 20 segundos no início do estiramento. Os dados experimentais iniciais sugerem que o beading é causado por um mecanismo relacionado ao axolemma, ou ao citoesqueleto, ou a ambos. Neste modelo, a proteína transmembrana β1-integrina se liga tanto à matriz extracelular quanto ao citoesqueleto.14 A tensão colocada na matriz extracelular é sinalizada através da β1-integrina ao citoesqueleto com a consequente alteração na sua integridade e disposição espacial. Entretanto, um estudo recente indicou que o beading não requer um citoesqueleto interligado e concluiu que o axolemma é o local inicial ou locus de constrição do beading.31 Vale a pena especular que o beading pode ser parte do processo biológico descrito como mudança axonal reativa na literatura relacionada à lesão axonal traumaticamente induzida.
Nos últimos quatro anos, o envolvimento do axolemma na patogênese da lesão axonal tornou-se estabelecido. Maxwell et al mostraram que o traumatismo crânio-encefálico grave causado pela aceleração lateral era capaz de rasgar diretamente o axolemma em primatas não humanos.32 Este estudo foi o primeiro a fornecer evidência ultra-estrutural que suportou o conceito de tosquia axonal no traumatismo crânio-encefálico. A perda da integridade axolemmal foi associada à rápida dissolução do citoesqueleto axonal. Nos axônios mostrando rasgamento ou fragmentação do axônio, a organização filamentosa do citoesqueleto foi substituída por um precipitado floculento consistente com uma rápida dissolução das proteínas citoesqueléticas subjacentes. Estas alterações foram detectadas em minutos após a lesão, mas só ocorreram numa subpopulação de axônios de calibre fino, finamente mielinizados, após lesão grave. Essas alterações morfológicas representaram uma resposta aguda dos axônios à lesão e foram denominadas “axotomia primária” – definida como ocorrendo dentro dos minutos de lesão, em contraste com a axotomia secundária retardada, que se desenvolve ao longo de um período de horas. No mesmo material experimental não houve evidência de ruptura do axolemma uma hora após a lesão. Isto sugere que a membrana axonal rompida se ressela dentro de uma hora de lesão.
Após esta publicação, Povlishock e colegas reconsideraram sua hipótese central, que não incluiu um papel do axolemma no início da lesão axonal induzida traumaticamente. Ao refletirem, sugeriram que o rasgamento direto do axolemma pode representar o fim mais severo de uma série de ruptura axolemmal.33 Este foi um ponto de inflexão importante, na medida em que, durante muitos anos, este grupo de pesquisa havia defendido que não havia evidências de alterações diretas no axolemma após a lesão em nenhum dos numerosos paradigmas que haviam investigado. Além disso, argumentaram que a patologia da lesão axonal induzida traumaticamente resultou do comprometimento direto do transporte axoplásmico devido às forças da lesão que interrompem diretamente o citoesqueleto axonal.71221
Em uma série de experimentos desenhados para investigar esta questão, Povlishock e colegas empregaram o traçador extracelular, peroxidase de rábano (HRP), para determinar se alterações diretas no axolemma eram detectáveis em lesões cerebrais traumáticas de gravidade leve e moderada.3334 Esta nova abordagem foi baseada no princípio de que traçadores macromoleculares como o HRP são normalmente excluídos do axoplasma por um axolemma intacto. Portanto, a detecção da atividade peroxidase intra-axonal constituiria evidência de ruptura axolemmal. Além disso, o local de atividade da peroxidase delimitaria o local inicial da pertubação axonal, permitindo o conhecimento dos fatores iniciadores envolvidos na patogênese da axotomia secundária. Seus achados mostraram que a patologia da lesão axonal traumaticamente induzida foi um processo heterogêneo e complexo, envolvendo múltiplas e variadas patologias iniciadoras.
Em particular, a gravidade da lesão traumática determinou eventos subsequentes no axolemma e no citoesqueleto, resultando em uma resposta diferencial ao insulto. Especificamente, após lesão moderada, pertubações diretas do axolemma refletidas em sua permeabilidade alterada às macromoléculas foram detectadas.33-35 Isto foi associado a uma rápida compactação local dos neurofilamentos axonais como evidenciado por uma diminuição na distância interfilamento. Entretanto, após leve traumatismo cranioencefálico, nenhuma evidência de alterações no axolemma foi detectada e um conjunto diferente de anormalidades citoesqueléticas, com desalinhamento e inchaço axonal, foram encontradas. Uma resposta diferencial à lesão havia sido previamente descrita em um modelo de carga de compressão da lesão axonal.36 Com baixa carga de tração, os axônios mostraram ruptura axoplasmática independente de qualquer alteração na integridade axolemmal, totalmente consistente com as alterações descritas com traumatismo crânio-encefálico leve. Com lesões mais graves, os mesmos axônios revelaram alteração axolemmal que se correlacionou com dramática falha axoplásmica. Estudos posteriores ampliaram esses achados, mostrando que essas alterações no axolemma e no citoesqueleto não são nem modelo3435 nem específicas da espécie.37 Além disso, após a demonstração de alterações traumáticas induzidas na permeabilidade axolemmal, os estudos sugeriram que o cálcio pode estar envolvido no início dos eventos citoesqueléticos. Esta aparente contradição com as visões anteriores decorreu do fato de que eles postularam que o cálcio estava agindo através de mecanismos previamente não identificados. Ao invés de ativar enzimas proteolíticas, o cálcio pode agir menos dramaticamente para alterar os neurofilamentos laterais, causando o colapso dos neurofilamentos resultando no aumento da sua densidade de acondicionamento. É concebível que esses neurofilamentos laterais possam ser clivados por processos mediados pelo cálcio ou desfoforados através das ações de quinases e fosfatases para resultar na alteração do espaçamento tridimensional dos neurofilamentos.1
Em conclusão, a controvérsia em torno do papel do axolemma na patologia da lesão axonal traumaticamente induzida foi resolvida até certo ponto. É agora acordado que a ruptura do axolemma é o evento inicial em certas formas de lesão traumática. Entretanto, a base mecanicista da axotomia secundária é agora vista como cada vez mais complexa, com alterações no citoesqueleto axonal demonstradas nas formas mais graves de lesão cerebral traumática.