Você está procurando começar a usar amostras de sangue em sua pesquisa translacional? Talvez você esteja interessado em câncer de mama metastático, ou pulmão não-celular pequeno. Ou talvez os desafios e limitações das amostras de tumores sólidos o façam pensar… está na hora.
Agora o quê?
Vamos analisar mais de perto a produção de DNA, e a realidade de trabalhar com DNA livre de células do plasma. O DNA livre de células (ou cfDNA) refere-se a todo o DNA não encapsulado na corrente sanguínea. Uma porção desse DNA livre de células se origina de um clone tumoral e é chamado de DNA tumoral circulante (ou ctDNA). cfDNA são fragmentos de ácido nucleico que entram na corrente sanguínea durante a apoptose ou necrose. Normalmente, esses fragmentos são limpos por macrófagos, mas acreditamos que a superprodução de células no câncer deixa mais do cfDNA para trás. Estes fragmentos têm em média cerca de 170 bases de comprimento, têm uma meia-vida de cerca de duas horas e estão presentes tanto na fase precoce como na fase tardia da doença em muitos tumores comuns, incluindo pulmão e mama de células não pequenas. Dito isto, a concentração de cfDNA varia muito, ocorrendo entre 1 e 100.000 fragmentos por mililitro de plasma.
Se você está no espaço de sequenciamento da próxima geração há algum tempo, talvez você queira saber sobre sensibilidade e especificidade. Nós demonstramos alta sensibilidade e especificidade para variantes em freqüência maior que um por cento com 20 nanogramas de DNA de entrada, e maior que cinco por cento com 5 nanogramas . Para ver mais sobre como fazer isso, confira nosso vídeo sobre os ensaios cfDNA. Você já deve ter ouvido falar sobre o uso do cfDNA para análises no limite de 1% de detecção do ponto zero. Enquanto a tecnologia existe para alcançar .01% (gota digital, por exemplo), há um limite biológico que precisamos falar.
De uma amostra de sangue de 10 mL, usando o Kit de Isolamento de DNA MagMAX Applied Biosystems, obtemos rotineiramente cerca de 20 nanogramas de cfDNA, ou cerca de 6 moléculas utilizáveis para análise. Alguns cálculos rápidos nos mostram que a 1% de limite de detecção, podemos esperar cerca de 25 moléculas. A 0,1% apenas 2-3 moléculas são esperadas para estar presentes. Isso significa que abaixo de 0,1% pode não haver nenhuma molécula presente para análise. Lembre-se, também, que as concentrações de cfDNA são altamente variáveis. Elas podem ser muito baixas em estágios críticos, tais como recorrência precoce ou desenvolvimento de resistência, onde muitos pesquisadores estão agora concentrados. Para isolar com sucesso 20 nanogramas de DNA do plasma sanguíneo, ambos métodos manuais e automatizados estão disponíveis dependendo de suas necessidades de produção.
DNA em mãos, sua pesquisa dita que caminho tomar neste ponto. Você pode escolher a PCR digital para estudos de monitoramento de recorrência. Para pesquisa na seleção terapêutica, um ensaio de sequenciamento de próxima geração pode ser preferido. Onde quer que sua pesquisa de biópsia líquida o leve, nós podemos ajudá-lo a chegar lá com soluções completas para análise de cfDNA, desde apenas alguns alvos até ensaios multi-gene.
Espero que tenhamos dado algumas coisas para você pensar ao considerar o uso de DNA livre de células em seu laboratório. Mas tenho certeza que você terá algumas perguntas. Então submeta suas perguntas em thermofisher.com/ask e inscreva-se em nosso canal para ver mais vídeos como este. E lembre-se, quando em dúvida, apenas Seq It Out!