Discussão
O gene Kit codifica um receptor de superfície celular, o c-Kit, (peso molecular 145-160 kd) que pertence à família do gene da imunoglobulina e carrega uma atividade intrínseca da tirosina quinase em sua porção citoplasmática. A interação do c-Kit com seu ligante, fator de aço, leva à dimerização do receptor, ativação da cinase, e fosforilação da tirosina das proteínas citoplasmáticas. O gene do c-Kit é expresso em melanócitos, gametócitos, mastócitos, células-tronco hematopoiéticas e células intersticiais de Cajal. Assim, o receptor da membrana quinase do Kit tirosina é essencial para melanogênese, gametogênese e hematopoiese durante o desenvolvimento embrionário e vida pós-natal.
c-Kit é expresso em melanoblastos durante a melanogênese a partir do momento em que eles deixam a crista neural. A expressão continua durante o desenvolvimento embrionário. Também é expressa nos melanócitos dos animais pós-natais. Assim, as mutações do gene do kit murino manifestam-se como manchas brancas dominantes (W). Além do gene do Kit, vários outros genes, como Pax3, Mitf, e Sox10, também podem estar envolvidos no fenótipo da mancha branca. As mutações nestes genes estão relacionadas com defeitos de desenvolvimento dos melanócitos. As mutações W ou alteram a sequência de codificação da tirosina quinase receptora do Kit, resultando em um receptor com atividade quinase prejudicada, ou afetam a expressão do Kit. As mutações W que afectam a expressão do Kit estão frequentemente localizadas na sequência regulamentar. Por exemplo, o alelo KitW-57J afeta o padrão temporal e espacial da expressão do Kit, de modo que os ratos KitW-57J/KitW-57J têm uma faixa irregular de manchas, não têm pigmentação nos pés e caudas, e têm um brilho na cabeça. O alelo do KitW-57J compreende uma deleção de 80 kb localizada no final da seqüência de codificação do Kit 5′. Os alelos KitW-bd e KitW-sh também afetam o padrão de expressão do Kit durante o estágio de desenvolvimento e os ratos KitW-bd/+ e KitW-sh/+ mostram uma faixa branca na região do tronco , . Ambos os alelos estão associados a uma inversão genómica localizada na região 5′ do gene do Kit . Estes achados indicam que a desregulação da expressão do Kit afeta o desenvolvimento de melanoblastos e, portanto, a mancha branca aparece em ratos mutantes.
Encontramos a inserção da seqüência ERV no intron 1 do gene do Kit do rato. As sequências ERV resultaram tanto de infecções antigas como modernas de retrovírus exógenos, que colonizaram com sucesso a linha germinal do seu hospedeiro . A inserção do ERV perturba os genes codificadores de proteínas do hospedeiro ou altera a expressão gênica, afetando a emenda ou fornecendo novos sinais para iniciação, regulação ou término da transcrição . As inserções ERV do primeiro intron com orientação antisense levam a um nível pequeno e inferior de transcrições, ou emendas aberrantes, em mutantes do rato. Assim, consideramos que a inserção do ERV que encontramos no alelo da capuz pode provocar a desregulação da expressão do Kit e assim provocar o padrão específico da capuz.
Encontramos também a sequência LTR solitária no alelo irlandês. Em ratos, sabe-se que a sequência ERV interna é eliminada através de recombinação homóloga entre o 5′ e os LTRs 3′ de modo a que um LTR solitário seja deixado para trás. Tal eliminação inverte o fenótipo mutante para o tipo selvagem ou, ocasionalmente, atenua o fenótipo mutante. Este último caso é encontrado na reversão do rato nonagouti (a) para o preto-e-branco (at) ou para o agouti de barriga branca (Aw). A inserção consiste em um elemento VL30 de 5,5-kb que incorporou 5,5 kb de seqüência adicional internamente; esta seqüência interna é ladeada por repetições diretas de 526-bp. A recombinação homóloga utilizando as repetições diretas 526-bp gera a em alelo, contendo apenas o elemento VL30 com uma única repetição interna 526-bp. A recombinação homóloga utilizando os VL30 LTRs gera o alelo Aw, contendo apenas um LTR LV30 solitário. O rato irlandês (oi) provoca uma mancha branca na barriga entre e atrás das pernas da frente. Portanto, concluímos que o LTR solitário no alelo irlandês também pode ter sido gerado pela recombinação homóloga entre o 5′ e 3′ LTRs do ERV do rato que é inserido no alelo encapuçado e que o alelo irlandês é um revertente parcial do alelo encapuçado devido ao LTR residual solitário.
Variações de cor do rato têm historicamente desempenhado papéis importantes nos estudos genéticos para entender os fundamentos da herança. Assim, a identificação da mutação causal das variações de cor seguida do levantamento das mesmas para as cepas existentes fornece uma visão da origem das mutações de cor do pêlo. Como as variações de cor da pelagem foram observadas nos primeiros dias da domesticação do rato, essa abordagem genética molecular poderia dar novos conhecimentos sobre o estabelecimento de cepas de rato em laboratório. No presente estudo, focalizamos as variações de cor mais antigas no rato, albino e encapuzado.
Coletamos tecidos ou DNAs de linhagens de ratos de todo o mundo a fim de cobrir todas as possíveis mutações de albino ou encapuzado que ainda estão disponíveis em linhagens de ratos de laboratório. Assim, parece muito provável que todas as estirpes albinas de ratos de laboratório desenvolvidas até agora partilhem apenas uma mutação comum: 299His no gene Tyr. A maioria das estirpes de ratos albinos existentes são derivadas de estirpes albinas ou de stocks do Instituto Wistar ou de cruzamentos entre ratos albinos Wistar e outros ratos, incluindo ratos selvagens. Os restantes ratos albinos não foram derivados directamente do Instituto Wistar (Tabela S1). As linhagens DON, Ihara e TO foram estabelecidas no Japão, enquanto as linhagens F344 e HTX foram estabelecidas nos EUA, e as linhagens Yagil foram estabelecidas em Israel. Elas também carregam a mesma mutação Tyr. Estas descobertas sugerem que a hereditariedade de todos os ratos albinos pode ser rastreada até um rato com a mutação albina.
Mais, descobrimos que todas as estirpes albinas que examinámos partilham a inserção de 7,098-bp ERV no gene Kit, sem qualquer excepção. De acordo com Donaldson, devem ter existido populações albinas e de capuz antes do estabelecimento da população albina de Wistar. Dados os genótipos uniformes para os albinos e mutações de capuz nas estirpes de ratos albinos, sugerimos dois cenários possíveis para os estabelecimentos das estirpes de albinos e capuzes. O mais provável é que a mutação do albino tenha ocorrido num rato de uma linhagem de rato de capuz. Daquela colônia, os primeiros ratos albinos foram descobertos e foram usados como fundadores de ratos albinos. Alguns ratos albinos foram introduzidos no Instituto Wistar e alguns foram usados para o desenvolvimento de populações albinas independentes de Wistar (Fig. 4). Outro cenário é que estirpes de ratos albinos tinham sido desenvolvidas independentemente do estoque de capuz e o cruzamento subsequente ocorreu entre o albino e o estoque de capuz. Nos estoques resultantes deste cruzamento, ratos albinos que carregavam o alelo de capuz (h) ou auto (H) devem estar presentes. Dada a evidência fornecida neste estudo, ratos albinos com o genótipo particular (h/h, c/c) foram selecionados “por acaso” e usados para estabelecer o estoque de ratos albinos. Tal estoque albino recém estabelecido foi introduzido no Instituto Wistar e alguns ratos foram usados para o desenvolvimento do estoque albino independente de Wistar (Fig. 4). Como a nossa pesquisa não conseguiu detectar nenhum rato albino sem a inserção do ERV encapuçado, o segundo cenário parece muito improvável e é apenas de natureza hipotética. Portanto, é muito provável que o stock de capuz tenha sido desenvolvido mais cedo do que as estirpes de albinos e que a mutação da falta de sentido do albino do rato tenha ocorrido num rato com capuz.
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Cenário 1: A mutação do albino de rato (299His) ocorreu num rato do stock de ratos encapuzados (piebald). A partir do estoque, o estoque de albino foi estabelecido. Então eles foram introduzidos no Instituto Wistar e alguns ratos albinos foram usados para o estabelecimento dos estoques independentes de Wistar. Cenário 2: O estoque albino que pode ser rastreado até um rato albino que carregava a mutação de 299H e o estoque encapuzado (piebald) foram estabelecidos independentemente. O cruzamento ocorreu entre o albino e os estoques encapuzados. Nos estoques resultantes deste cruzamento, ratos albinos que carregavam o alelo de capuz (h) ou auto (H) devem estar presentes. Os ratos albinos com o genótipo particular (h/h, c/c) foram selecionados “por acaso” e usados para estabelecer o estoque de ratos albinos. Esse novo estoque albino estabelecido foi introduzido no Instituto Wistar e alguns ratos dele foram usados para o desenvolvimento do estoque albino independente de Wistar.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043059.g004