4.3. Estrutura do receptor nicotínico
O receptor nicotínico do órgão elétrico e músculo esquelético vertebrado é um pentamer composto por quatro subunidades distintas (a, b, g e d) na razão estequiométrica de 2:1:1:1, respectivamente. Nas placas terminais musculares maduras, a subunidade g é substituída por e, uma subunidade intimamente relacionada. As subunidades individuais são cerca de 40% idênticas em suas seqüências de aminoácidos, decorrentes de um gene primordial comum. O receptor nicotínico se tornou o protótipo para outros canais de íons pentamericanos de ligação, que incluiu os receptores para os aminoácidos inibidores (ácido g-aminobutírico e glicina) e certos receptores de serotonina (5-HT3). Cada uma das subunidades do receptor pentamericano tem uma massa molecular de 40 000 a 60 000 daltons. Os resíduos amino-terminal 210 constituem praticamente todo o domínio extracelular. Seguem-se quatro domínios transmembrana (TM); a região entre o terceiro e quarto domínios forma a maior parte do componente citoplasmático. Cada uma das subunidades dentro do receptor nicotínico ACh tem uma exposição extracelular e intracelular na membrana pós-sináptica. As cinco subunidades estão dispostas em torno de um pseudo-eixo de simetria para circunscrever um canal localizado internamente,.
O receptor é uma molécula assimétrica (14 nm×8 nm) de 250 000 daltons, com a maior parte do domínio não membranar na superfície extracelular. Em áreas juncionais (ou seja, a placa terminal motora no músculo esquelético e a superfície ventral do órgão elétrico), o receptor está presente em altas densidades (10 000/mm2), em ordem regular de empacotamento. Esta ordenação dos receptores permitiu a reconstrução da imagem microscópica electrónica da sua estrutura molecular. Uma proteína de ligação ACh homóloga apenas ao domínio extracelular do receptor nicotínico foi identificada em caracóis de água doce e salgada e caracterizada estrutural e farmacologicamente.
Esta proteína monta-se como um pentamer homomérico e liga os ligandos do receptor nicotínico com a selectividade esperada; a sua estrutura cristalina revela uma organização atómica esperada do receptor nicotínico. Além disso, a fusão da proteína de ligação ACh e os intervalos transmembrana do receptor produzem uma proteína funcional que exibe o canal de alimentação e mudanças no estado esperado do receptor. Esta proteína de ligação serve como um substituto estrutural e funcional do receptor e tem proporcionado uma compreensão detalhada dos determinantes que governam a especificidade dos ligantes do receptor nicotínico. Os sítios de ligação agonista são encontrados nas interfaces das subunidades, mas no músculo, apenas duas das cinco interfaces das subunidades, um g e um d, evoluíram para ligandos de ligação. A ligação de agonistas, antagonistas competitivos reversíveis e a elapid a toxina é mutuamente exclusiva e envolve superfícies sobrepostas no receptor. Ambas as subunidades que formam a interface da subunidade contribuem para a especificidade dos ligantes. As medições das condutas de membrana demonstram que as taxas de translocação de íons são suficientemente rápidas (5×107 íons por segundo) para requerer a translocação de íons através de um canal aberto em vez de por um portador rotativo de íons. Além disso, mudanças mediadas por agonistas na permeabilidade do íon (tipicamente um movimento de entrada de principalmente Na+ e secundariamente Ca2+) ocorrem através de um canal catiônico intrínseco à estrutura receptora. A segunda região transmembrana em cada uma das cinco subunidades forma o perímetro interno do canal. O local de ligação agonista está intimamente ligado a um canal iônico; no receptor muscular, a ligação simultânea de duas moléculas agonistas resulta em uma rápida mudança conformacional que abre o canal. Tanto a resposta de ligação como a resposta de ligação mostram uma cooperatividade positiva. Detalhes sobre a cinética da abertura do canal evoluíram das técnicas de patch clamp eletrofisiológicas que distinguem os eventos individuais de abertura e fechamento de uma única molécula receptora e confirmam que os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) são canais de íons ligados pentamericanos que são compostos de subunidades que consistem de um domínio extracelular que carrega o local de ligação ligante e um domínio íon-poro distinto. A transdução de sinal resulta do acoplamento alostérico entre os dois domínios, sendo que a distância do local de ligação ao portal do domínio poroso é de 50 Å. No entanto, os estudos de ligação de receptores são específicos para receptores colinérgicos nicotínicos que foram realizados em epitélios vestibulares isolados dos sapos Rana catesbiana e Rana temporaria. Evidências são apresentadas para a presença de receptores colinérgicos do tipo nicotínico especificamente associados às áreas sensoriais, e a ligação estudada de conformações atípicas de agonistas nicotínicos conferindo seletividade subtipo e conclui que a RNAA tem um papel crucial na neurotransmissão excitatória e desempenha um importante alvo para drogas e inseticidas. Diversos subtipos de nAChR com várias combinações de subunidades conferindo seletividade diferencial para drogas nicotínicas, e também identificou a família de genes codificadores para proteínas homólogas à subunidade α do receptor muscular nicotínico acetilcolina no genoma do rato. Estes genes são transcritos no sistema nervoso central e periférico em áreas que são conhecidas por conterem receptores nicotínicos funcionais. O papel desempenhado pelo β2 contendo receptores neuronais nicotínicos (nAChRs) na mediação dos efeitos colaterais da nicotina no feto e no recém-nascido. Ratos grávidas WT e mutantes sem a subunidade β2 nAChR foram implantados com mini-bombas osmóticas que forneciam água ou uma dose controlada de nicotina. Posteriormente, houve uma comparação do desenvolvimento do sistema simpático e dos reflexos respiratórios e de excitação da prole pouco tempo após o nascimento, um período de maior vulnerabilidade à exposição à nicotina. Por outro lado, os neonicotinóides, como o imidaclopride, são agonistas do NAChR com potente atividade inseticida. Desde sua introdução no início dos anos 90, o imidaclopride tornou-se um dos inseticidas mais amplamente utilizados tanto para a proteção das culturas quanto para aplicações na saúde animal, a base molecular da resistência ao imidaclopride, cinco subunidades do nAChR (Nlα1-Nlα4 e Nlβ1) foram clonadas a partir de Nilaparvata lugens. Uma comparação dos genes das subunidades nAChR de populações sensíveis ao imidaclopride e resistentes ao imidaclopride identificou uma mutação de ponto único em uma posição conservada (Y151S) em duas subunidades nAChR, Nlα1 e Nlα3. Foi demonstrada uma forte correlação entre a frequência da mutação pontual Y151S e o nível de resistência ao imidaclopride por PCR específica do alelo. Pela expressão de nAChR híbridos contendo Nilaparvata lugens α e rat β2 subunidades, foram obtidas evidências que demonstram que a mutação Y151S é responsável por uma redução substancial na ligação específica ao imidaclopride. Este estudo fornece evidência direta para a ocorrência de resistência do local alvo a um inseticida neonicotinóide, e investigou a natureza do local de ligação de catião-π no receptor nicotínico e descobriu que o receptor nicotínico de acetilcolina é o protótipo do canal de íons ligado-agregado. Vários aminoácidos aromáticos foram identificados como contribuindo para o local de ligação do agonista, sugerindo que as interações catil-π podem estar envolvidas na ligação do grupo amônico quaternário do agonista, a acetilcolina. A conformação das moléculas colinérgicas nos receptores nervosos nicotínicos, e encontra uma correlação das análises da estrutura cristalina dos potentes agonistas nicotínicos acetilcolina, acetil-α-metilcolina, lactoilcolina, 1,1-dimetil-4-fenilpiperazina e nicotina permite determinar a conformação dos agonistas colinérgicos relevantes para os receptores nervosos nicotínicos. A expressão dos receptores neurotransmissores codificados por mRNAs isolados a partir de três linhas celulares de glioma humano. Oócitos injetados com mRNAs de duas linhas celulares de glioblastoma não mostraram respostas elétricas aos vários neurotransmissores testados.
Modulação de nAChR por estricnina descobre que a estricnina é um potente e seletivo antagonista nos receptores de glicina que foi encontrado para inibir os músculos (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ, e α 1β 1δ) e neuronais (α 2β 2 e α 2β 4) receptores nicotínicos de acetilcolina (AcChoRs) expressos em oócitos de Xenopus. Somente a estricnina (até 500 µmol/L) não produziu correntes de membrana em oócitos expressando AcChoRs, mas quando foi aplicada antes, concomitantemente, ou durante a superfusão de acetilcolina (AcCho), inibiu rápida e reversivelmente a corrente elicitada pelo AcCho (AcCho-current). A tradução da codificação do RNA mensageiro exógeno para nAChRs produz receptores funcionais em oócitos Xenopus, neste estudo o RNA mensageiro extraído do órgão elétrico do Torpedo foi injetado em oócitos Xenopus. Isto levou à síntese e incorporação de receptores funcionais de acetilcolina na membrana do oócito. Quando ativados pela acetilcolina, estes receptores de acetilcolina de Torpedo na membrana do oócito abriram canais cuja permeabilidade iônica se assemelhava à dos receptores nicotínicos em outras células.
A localização dos receptores de acetilcolina (AChR) na superfície do desenvolvimento de células miogênicas dos músculos latissimus dorsi anterior e posterior do embrião de pinto em relação ao processo de inervação foi estudada a nível ultra-estrutural utilizando um conjugado de peroxidase-α-bungarotoxina de rábano. Concentrações localizadas de RCA foram encontradas em pequenas regiões 0,1-0.Foram estudados 4 µm de largura na superfície de células miogênicas de músculos com 10 a 14 dias de idade, e também foram estudados efeitos da acetilcolina e agentes que imitam ou bloqueiam suas ações fisiológicas em concentrações de guanosina 3′:5′- monofosfato cíclico (GMP cíclico) e adenosina 3′:5′- monofosfato cíclico (AMP cíclico) em fatias de córtex cerebral de mamíferos, ventrículo cardíaco e íleo. A acetilcolina e os agentes colinomiméticos com ação predominantemente muscarínica, como a metacolina, o betanecol e a pilocarpina, induziram e aumentaram a concentração de GMP cíclico ou uma leve diminuição da concentração de AMP cíclico, em todos os três tecidos estudados.
As propriedades funcionais e localização celular do neuronal humano α7 AcCho receptor (α7 AcChoR) e sua forma mutante (mut) L248T foram investigadas expressando-as isoladamente ou como fusões de genes com a versão melhorada da proteína fluorescente verde (GFP). Os oócitos Xenopus injetados com o tipo selvagem, mutα7, ou a subunidade quimérica cDNAs expressaram os receptores que gated membrana correntes quando expostos ao AcCho. Como já se sabe, as correntes AcCho geradas pelos receptores wtα7 decaem muito mais rapidamente do que as elicitadas pelos receptores mutα7. A interação dos receptores nicotínicos β2 e das vias de dopamina no controle da locomoção espontânea, e encontra a acetilcolina (ACh) é um modulador conhecido da atividade dos neurônios dopaminérgicos (DAergic) através da estimulação dos nAChRs. No entanto, a composição da subunidade e a localização específica das nAChRs envolvidas na locomoção mediada por DA-mediated permanecem para ser estabelecidas in vivo. Ratos sem a subunidade β2 de nAChRs (β2KO) apresentam uma hiperatividade impressionante em campo aberto, o que sugere um desequilíbrio na neurotransmissão DA. Entretanto, a mutação dentro do domínio M2 do receptor nicotínico converte a 5-hidroxitriptamina de antagonista para agonista, o estudo foi feito sobre os efeitos da 5-hidroxitriptamina (5HT) nos receptores neuronais nicotínicos homoméricos (nAcChoR) expressos em oócitos Xenopus após a injeção de cDNA codificando a subunidade de galinha do tipo selvagem. AcCho eliciou grandes correntes que foram reduzidas em 5HT de forma reversível e dose-dependente, com uma concentração semi-inibitória e um coeficiente de Hill. Embora o estudo do receptor colinérgico de linfócitos T citotóxicos e agonistas colinérgicos tenha a capacidade dos linfócitos sensibilizados de ferir células portadoras dos aloantigénios sensibilizantes, o receptor colinérgico da população de linfócitos atacantes tem sido estudado com manipulação farmacológica de um sistema in vitro que quantifica a lesão mediada por células atacantes sensibilizadas sobre células alvo.