Discussão
Um dos problemas mais graves relacionados ao tratamento das infecções causadas por C. striatum é o isolamento de cepas multirresistentes do material clínico e a seleção da antibioticoterapia apropriada para um determinado tipo de infecção. As infecções por C. striatum devem ser tratadas de acordo com os resultados dos testes de susceptibilidade. A resistência a múltiplas drogas é causada pela interação de múltiplos mecanismos de resistência que surgem através da aquisição de determinantes de resistência estranhos ou mutações espontâneas. Este trabalho destaca a alta prevalência de cepas multi-resistentes e genes de resistência entre o C. striatum isolado em um hospital na Tunísia, em particular a resistência aos aminoglicosídeos, compostos do grupo MLSB, fluoroquinolonas, e β-lactams.
Os 63 C. striatum analisados neste estudo foram suscetíveis à vancomicina e linezolida. Em um relatório anterior utilizando o método de difusão em disco, Martinez et al.19 mostraram que 31 C. striatum isolados de amostras clínicas eram suscetíveis à vancomicina. Mais recentemente, Gomila et al.20 relataram que seu estriato de 52 C. isolado de pacientes com doença respiratória obstrutiva crônica também eram suscetíveis à vancomicina. A vancomicina ainda hoje está ativa e, portanto, representa uma opção adequada para o tratamento de infecções graves causadas pelo estriato C. A linezolida também mostrou uma excelente atividade, com MICs rotineiramente abaixo de 0,5 mg/L21. Gómez-Garcés et al.22 mostraram que a vancomicina e a linezolida eram igualmente activas contra 30 C. striatum clínicos (MICs90 de ambos os compostos = 0,5 mg/L). A linezolida pode ser considerada como uma alternativa à vancomicina contra o C. striatum, embora seus efeitos colaterais durante os longos cursos de tratamento necessários para hardware ou infecções associadas a dispositivos devam ser ponderados. Todos os nossos C. striatum eram susceptíveis à daptomicina (MIC90 = 0,25 mg/L). A daptomicina também foi comprovadamente activa contra o C. striatum, sozinha23 ou combinada com rifampicina24. Portanto, a daptomicina também pode ser considerada como uma alternativa à vancomicina para o tratamento de infecções por C. striatum, embora tenha sido recentemente relatado o rápido surgimento de alta resistência à daptomicina25, 26,
Aminoglicosídeos são usados como antibióticos complementares para tratar infecções graves causadas por difteróides. Entre os aminoglicosídeos, amikacina e gentamicina mostraram boa atividade “in vitro” contra nosso estriato C. (MICs90 = 1 e 2 mg/L, respectivamente). A resistência aos aminoglicosídeos ocorre através de vários mecanismos que podem coexistir simultaneamente na mesma célula. A inativação enzimática da molécula antibiótica é a mais prevalente no ambiente clínico. O gene aac(3)-XI, codificando uma aminoglicosídeo 3-N acetil transferase conferindo resistência à gentamicina e à tobramicina em C. striatum27, não foi encontrado em nossos isolados resistentes à 3 gentamicina, sugerindo que a resistência é mediada por outro mecanismo. A canamicina e a estreptomicina não são utilizadas na prática clínica na Tunísia, mas foram testadas neste estudo porque são bons marcadores para detectar a presença dos genes aph(3′)-Ic, aph(3″)-Ib e aph(6)-Id. O gene aph(3′)-Ic, codificando uma aminoglicosida-O-fosfotransferase implicada na resistência à canamicina, neomicina, paromomicina, ribostamicina e lividomicina, é parte de uma região maior de DNA contendo o gene aph(3″)-Ib – aph(6)-Id par de genes de resistência conferindo resistência à estreptomicina em Corynebacterium spp28. Regiões idênticas de resistência aos aminoglicosídeos foram encontradas no plasmídeo pTP10 de C. striatum, nas proximidades das regiões de resistência à eritromicina e ao cloranfenicol29. Como esperado, o Striatum 10 C. resistente à canamicina carregava o gene aph(3′)-Ic. Entretanto, esse gene também foi detectado em cepas suscetíveis à canamicina, provavelmente devido a mutações que afetaram sua seqüência de codificação ou seu promotor. Estes resultados confirmam que o gene aph(3′)-Ic está disseminado em Corynebacterium spp. A resistência à estreptomicina em Corynebacterium spp. está relacionada à presença do tandem dos genes aph(3″)-Ib e aph(6)-Id, codificando para aminoglicoside-3″-fosfotransferase e aminoglicoside-6-fosfotransferase , respectivamente28. Cinco dos 8 isolados resistentes à estreptomicina carregavam os genes aph(3″)-Ib e aph(6)-Id, e os três restantes tinham MICs para estreptomicina na faixa de 1 a 4 mg/L, provavelmente como consequência de mutações nos genes acima mencionados ou em seu promotor. Outros mecanismos, como efluxo ativo do antimicrobiano e ingestão reduzida na célula bacteriana, podem contribuir para a resistência à estreptomicina nestes isolados. Amikacina é eventualmente prescrita em terapia combinada contra infecções graves causadas por C. striatum no hospital da FHU. Os nossos resultados indicam que o amikacin é o aminoglicosídeo preferível para o tratamento de infecções por C. striatum, enquanto a gentamicina pode ser uma alternativa válida. Entretanto, a ocorrência de cepas resistentes requer vigilância contínua.
Eritromicina e clindamicina estavam inativos contra a maioria do nosso C. striatum, em particular a clindamicina, com uma MIC90 oito vezes maior que a eritromicina. Este fato confirma a alta prevalência previamente relatada de resistência a compostos do grupo MLSB entre Corynebacterium spp., incluindo C. striatum30. A resistência do MLS em Corynebacterium spp. é mais freqüentemente mediada por dois mecanismos: modificação do local alvo mediada pelas metilases do RNA ribossômico codificadas pelos chamados genes erm e fluxo ativo de drogas mediado por uma bomba de efluxo de membrana codificada pelo gene mef(A-E)31. Nossos resultados confirmaram os de estudos anteriores que apontaram que erm(X) é o gene mais importante implicado na resistência do MLS em Corynebacterium spp29, 32. Pela primeira vez detectamos o gene erm(B) que codifica a ribossomal RNA metilase Erm(B) em C. striatum. O gene erm(B) confere alta resistência a macrólidos em Campylobacter coli33 e outros patógenos relevantes, mas é excepcional em Corynebacterium spp31, 34. Dez de nossas cepas carregaram os genes erm(B) e erm(X) simultaneamente, uma característica previamente relatada apenas em uma cepa de C. urealyticum31.
Um terço de nosso C. striatum mostrou resistência intermediária ou de alto nível à ciprofloxacina e moxifloxacina. Fluoroquinolonas têm sido intensamente utilizadas no hospital FHU durante as últimas duas décadas. Após a administração de antibióticos, uma pressão seletiva é criada nos órgãos do corpo onde as fluoroquinolonas tendem a se acumular. A exposição às fluoroquinolonas seleciona para mutantes espontâneos em grandes populações bacterianas, incluindo aquelas que colonizam a pele e membranas mucosas, como as córneas. Assim, a resistência às fluoroquinolonas surgiu em isolados clínicos de C. striatum e C. amycolatum35. A resistência às fluoroquinolonas em Corynebacterium spp. é causada por mutações no QRDR do gene gyrase gyrA. Em nossas cepas, substituições simples de aminoácidos na posição 87 da proteína GyrA geraram resistência à ciprofloxacina, mas mutações duplas no gene gyrA levando a mudanças nas posições 87 e 91 foram necessárias para um alto nível de resistência à ciprofloxacina e moxifloxacina. Em catorze dos 21 striatum C. resistentes à fluoroquinolona, aumentos de MICs de ciprofloxacina e moxifloxacina até 16 mg/L foram relacionados a uma dupla mutação não conservadora nas posições 87 e 91. Sierra et al.35 também relataram mutações duplas nas posições 87 e 91 no gene gyrA de seis de seu C. striatum, embora os MICs de moxifloxacina para suas cepas fossem menores (6-8 mg/L). Cinco de nossas cepas com mutações simples nas posições 87 ou 91 ainda são resistentes à ciprofloxacina, embora com MICs mais baixas (na faixa de 2-8 mg/L), enquanto as MICs de moxifloxacina permaneceram em 1 mg/L. Mutações únicas no resíduo Ser-87 ou no resíduo Asp-91 descrito por Sierra et al.35 aumentaram as MICs de ciprofloxacina para 1-6 mg/L, enquanto que permaneceram susceptíveis à moxifloxacina. O maior nível de resistência à moxifloxacina em nossas cepas sugere a existência de um mecanismo de resistência adicional às mutações em giroscópio. Em duas cepas não foram detectadas alterações em seus QRDRs, indicando que a resistência foi mediada por um mecanismo diferente.
β-lactams são a classe mais amplamente utilizada de antimicrobianos. Foram relatados tratamentos bem sucedidos de infecções de C. striatum com penicilina36 ou amoxicilina37. No entanto, a baixa susceptibilidade à penicilina e à cefotaxima entre outros β-lactams foram comunicados10, 38, embora o mecanismo genético de resistência não tenha sido caracterizado até agora. Considerando os valores de MICs90 (16 mg/L), a penicilina e a cefotaxima apresentaram a mesma baixa actividade contra o nosso C. striatum. O facto de a taxa de estirpes resistentes à penicilina ser superior à das cefotaximas explica-se porque o ponto de quebra de susceptibilidade CLSI para a penicilina caiu recentemente de 1 mg/l para 0,125 mg/L39. A hidrólise dos antibióticos β-lactamais por β-lactamases é o mecanismo de resistência mais comum para esta classe de agentes antibacterianos em bactérias clinicamente importantes. As β-lactamases são classificadas por sequência de proteínas em quatro classes moleculares, A, B, C, e D, com base em motivos conservados e distintos de aminoácidos. Cinquenta e duas de nossas cepas eram resistentes à penicilina e essa resistência estava relacionada à presença de um gene bla que codificava uma classe A β-lactamase. Os cromossomos de Corynebacterium jeikeium K41140, Corynebacterium urealyticum DSM 710941 e Corynebacterium resistem ao DSM 4510042, codificam as contrapartidas correspondentes do gene C. striatum bla, embora não tenha sido associado à resistência aos lactams β-lactams nestas espécies. O gene ampC, codificando uma classe C β-lactamase, foi detectado em 42 dos 52 striatum C. resistentes à penicilina. Os genes ampC, que estão amplamente distribuídos entre as Enterobacteriaceae, codificam enzimas ativas tanto nas penicilinas quanto nas cefalosporinas43. Mostramos aqui que dois genes codificadores de Lactama, bla e ampC, estão presentes em β-lactam-resistente C. striatum. Nossos dados revelaram altas taxas de resistência aos β-lactams e uma alta prevalência dos genes bla e ampC entre os genes C. striatum isolados em nosso hospital. Estes dados são de valor para os profissionais, desencorajando o uso de compostos de β-lactam no tratamento de infecções causadas por C. striatum.
PFGE é considerado o padrão-ouro em estudos epidemiológicos de microrganismos patogênicos, fornecendo importantes insights sobre sua estrutura populacional44. Nossos resultados mostraram 22 padrões de PFGE distintos das cepas de estriato C. 63. A alta diversidade de genótipos entre as cepas de 63 C. striatum revelou que eles não estão, em sua maioria, intimamente relacionados. Portanto, o C. striatum no hospital FHU pode ter origem em diferentes linhagens e fontes, ao invés da expansão de uma única linhagem clonal. Isto corresponde à condição patogênica do C. striatum como um patógeno oportunista que causa doenças ocasionais em pacientes predispostos. Alguns padrões de PFGE foram mais frequentemente isolados, sugerindo a existência de alguns clones mais prevalentes. Consideramos os padrões E e A como pulsótipos de alta prevalência. A maioria dos striatum de C. atribuídos aos pulsótipos E e A eram altamente resistentes, indicando que os clones mais prevalentes são altamente resistentes, como já foi relatado anteriormente10,16. O fato de muitos perfis diferentes de resistência a antibióticos poderem ser distinguidos entre as cepas pertencentes a um determinado padrão de PFGE revelou que não havia uma única cepa, mas vários clones estreitamente relacionados produzindo infecções esporádicas.
Em conclusão, este estudo destaca a relevância do C. striatum como um patógeno nosocomial multirresistente emergente no hospital da FHU. Os isolados de C. striatum mostraram 100% de susceptibilidade à vancomicina, linezolida e daptomicina e altas taxas de resistência à rifampicina, compostos do grupo MLSB, fluoroquinolonas e β-lactams. Entre os vários clones de C. striatum circulantes no hospital de FHU, os mais prevalentes foram os mais resistentes. Portanto, a vigilância do MDR C. striatum deve ser continuada.