Abstract
A combinação de trombofilia e gravidez aumenta o risco de trombose e o potencial para resultados adversos durante a gravidez. O fator de risco hereditário mais significativo para trombofilia é a resistência à proteína C ativada (APCR), uma resposta anticoagulante pobre da APC em hemostasia, que é causada principalmente por um polimorfismo hereditário de nucleotídeo único (SNP), fator V G1691A (FV Leiden) (FVL), referido como APCR hereditário. Mudanças nos níveis dos fatores de coagulação: FV, FVIII e FIX, e fatores anticoagulantes: proteína S (PS) e proteína C (PC) podem alterar a função APCR causando APCR adquirida. Protrombina G20210A e metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) C677T são SNPs protrombóticos que em associação com APCR também podem aumentar o risco de trombose entre caucasianos. Neste estudo, foi demonstrada uma correlação entre um fenótipo adquirido de APCR e níveis aumentados dos fatores V, VIII, e IX. Mutações trombofílicas entre nossa coorte adquirida de mulheres grávidas com APCR são relativamente comuns, mas não parecem exercer um efeito adverso grave e indevido na gravidez.
1. Introdução
A gravidez aumenta o risco de trombose. O fenótipo APCR tem sido associado ao tromboembolismo venoso (TEV), a principal causa de morte materna em países desenvolvidos.
Em condições normais, o APC inativa a proteína coagulante ativa do VF(a), clivando em uma seqüência ordenada locais específicos de VF(a). O primeiro sítio de clivagem é Arginina (Arg) 506, e o segundo é (Arg) 306 seguido por (Arg) 679 . As mutações no gene FV têm sido relacionadas com a APCR. O FVL é relatado em cerca de 90% dos pacientes com APCR na população geral . Outros SNPs no gene do fator V que podem contribuir para a APCR herdada independentemente ou encontrados em associação com a mutação FVL incluem Cambridge Arg306, Hong Kong, Arg306, o Arg679, e os polimorfismos haplótipos (H) R2 e R3. Entretanto, relatos sobre a contribuição dessas mutações para o fenótipo APCR são conflitantes .
A fisiopatologia subjacente à APCR não causada pela mutação FVL ainda não foi completamente compreendida. Em diferentes estudos, tem sido sugerido que fatores adquiridos podem ser a causa da APCR na ausência do FV Leiden . Diversos fatores de coagulação podem afetar o tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT). A literatura anterior sugeria uma possível correlação positiva entre os níveis dos fatores V, VIII e IX e a APCR adquirida. Proteína S e proteína C, os níveis podem (ou podem) afetar a APCR adquirida, mas sua influência sobre a resistência parece estar ainda dentro da faixa de níveis normais .
Outros SNPs conhecidos associados à trombofilia e resultados adversos durante a gravidez são a protrombina G20210A e o MTHFR C677T .
Protrombina G20210A está associada a um aumento no nível de proteína protrombina (FII) no plasma e um aumento de 3 vezes nos eventos trombóticos resultantes. A mutação da protrombina G20210A parece aumentar o risco de trombose em mulheres grávidas em aproximadamente dez vezes com o risco de desenvolver complicações obstétricas aumentado em quatro vezes .
O MTHFR C677T tem sido associado com complicações obstétricas e com defeitos congênitos .
Em um estudo anterior neste laboratório, identificamos SNPs conhecidos e novos em um pequeno número de sujeitos com APCR determinados usando o teste Coatest modificado que não apresentava a mutação FVL .
Os principais objetivos deste estudo foram (1) determinar e comparar os níveis dos fatores V, VIII, e IX nos grupos APCR adquiridos, APCR herdados, e APCR-negativos, (2) comparar a frequência de resultados adversos nos grupos APCR-positivos (adquiridos e herdados) e APCR-negativos, e (3) determinar a frequência de resultados adversos da gravidez, associados a mutações trombófilas que não a mutação FVL na nossa coorte de estudo (𝑛=907). Os resultados adversos de gravidez observados neste estudo incluíram (anteriores) perda de gravidez precoce recorrente (REPL), pré-eclâmpsia (PET) e restrição de crescimento intra-uterino (IUGR). Hipertensão induzida na gravidez (PIH), (IUFD) intra-uterino morto, e baixo peso ao nascer (LBW).
2. Materiais e Métodos
2.1. Sujeitos
A aprovação ética do estudo foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa, e o consentimento por escrito para coleta de amostras foi obtido das 907 gestantes incluídas neste estudo que compareceram para triagem gestacional ambulatorial de rotina na clínica pré-natal do Hospital Universitário Universitário de Galway (UCHG). A Tabela 1 detalha os dados demográficos dos sujeitos do estudo.
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| SVD: Parto vaginal espontâneo; AV: vaginal assistido; CS: cesariana. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Amostras de sangue (Heparina de lítio e EDTA) foram coletadas de sujeitos entre a 16ª a 24ª semana de gestação. Neste segundo trimestre de gestação, pouca ou quase nenhuma variação nos fatores de coagulação foi mostrada, o que é apropriado para a avaliação do estado de APC. O teste do estado de CPA antes ou entre 8 e 12 semanas após a gravidez ou com maior frequência durante a gravidez teria determinado uma relação de CPA estável mais precisa; esta é uma limitação do estudo atual. A análise laboratorial da resposta anticoagulante deficiente ao CPA é baseada em um ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT). Uma relação reduzida reflete a taxa reduzida de inativação. A razão de corte utilizada para determinar o APCR positivo para este estudo foi um valor menor ou igual a 2,1 segundos (s). Este valor foi determinado pelo departamento de hematologia e está em uso clínico na UCHG. A razão de corte utilizada para determinar a APCR pode variar em sensibilidade e especificidade dependendo da metodologia, equipamento e tecnologia utilizada em diferentes laboratórios.
2,2. APC Status by Classic Coatest Test in Order to Identify Acquired APCR Samples
Blood samples were centrifuged at 4,000 rpm for 5 min, and aliquots of platelet-poor plasma were frozen at -80°C until the assay took place. O plasma foi incubado com um volume igual de reagente aPTT durante 5 min a 37°C. A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2, e os tempos de coagulação foram expressos como uma proporção do tempo de coagulação na presença de APC dividido pelo tempo de coagulação na ausência de APC.
2.3. APC Status by Modified Coatest Test in Order to Identify Inherited APCR Amostras de APCR
Amostras de coagulação foram primeiro diluídas 1 em 5 com plasma com fator V-deficiente que contém um neutralizador de heparina, e depois foi testado como descrito para o teste APCR clássico Coatest. A adição do plasma com fator V-deficiente corrige deficiências de outras proteínas de coagulação, neutraliza as concentrações terapêuticas de heparina e elimina o efeito de alguns inibidores de lúpus. APCR na presença de plasma pobre em fator V foi avaliada usando o kit Coatest APCR e plasma pobre em fator V (Chromogenix) .
2.4. Extração de DNA
DNA foi extraído de amostras de sangue para todos os sujeitos APCR (𝑛=140) e amostras de controle (APCR negativo 𝑛=31) usando uma modificação do protocolo CF(12)m-PCR pela Ortho-Clinical Diagnostics, Amersham, Reino Unido. A análise espectrofotométrica de absorvância a 260 nm foi realizada em um espectrofotômetro Heλios α (Unicam Ltd., Inglaterra) para cada amostra de DNA, e o rendimento médio para DNA foi determinado como sendo de 30 ng/μL.
2.5. Triagem de Mutação
Análise da enzima de restriçãoPCR (PCR-REA) foi aplicada para identificar G20210A no gene FII, C677T no gene MTHFR, e mutações FVL, FV Cambridge, FV Hong Kong, e Haplótipo (H) R2, alelo no gene FV usando modificações de métodos previamente publicados . A análise de hibridização da sonda de DNA e/ou sequenciamento de DNA foi aplicada para a detecção de Arg679, conforme descrito . Cento e quarenta sujeitos APCR-positivos e 31 sujeitos APCR-negativos foram testados para todas as mutações. Nosso grupo de indivíduos controle testados para mutações trombofílicas, 𝑛=31, foi escolhido aleatoriamente entre os 767 indivíduos negativos APCR identificados como normais com o teste APCR clássico Coatest. Uma média de 2,59 e desvio padrão de 0,2804 foram identificados para este grupo de sujeitos negativos da APCR de 𝑛=767 sujeitos. Por outro lado, foi identificada uma média de 1,745 e desvio padrão de 0,1104 para o APCR positivo (herdado mais adquirido) 𝑛=140. O valor mínimo identificado para a APCR negativa foi de 2,160 enquanto para a APCR positiva foi de 1,490. O valor máximo de APCR negativo identificado foi de 3,030, enquanto que para APCR positivo foi de 2,060 segundos. Mutações trombofílicas estão interferindo no equilíbrio da coagulação, variando o tempo de aPTT relacionado ao intervalo da razão APC.
Todas as mutações foram rastreadas em controles duplicados e controles positivos consistindo de DNA de indivíduos heterozigotos e homozigotos para mutações FVL e MTHFR-C677T, e indivíduos heterozigotos para outras mutações investigadas foram incluídos onde estava disponível. Em cada PCR foi incluído um controlo negativo, consistindo em água em vez de um modelo de ADN. A amplificação PCR foi realizada no GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, EUA).
2.6. Sequenciamento de DNA Verificando Mutações Identificadas
Sequenciamento de DNA em 50% dos produtos PCR de sujeitos testados para a mutação Arg679 foi realizado para verificar o genótipo normal obtido pela análise de hibridação da sonda Southern blot-DNA para estes sujeitos. Os produtos de PCR 400 bp do Exon 13 contendo o sítio Arg679 do gene FV foram purificados utilizando o QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Ltd, UK) de acordo com as instruções do fabricante e enviados para sequenciação de ADN a um fornecedor de serviços de sequenciação externo (MWG Biotech, Alemanha). Uma amostra positiva para a mutação de Cambridge por PCR/REA também foi purificada usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Ltd, UK) e enviada para sequenciação para confirmar a mutação Arg306.
2.7. Os níveis dos Factores V, VIII, e IX
Níveis foram determinados para os grupos APCR-positivos e APCR-negativos usando um ensaio APTT de uma fase num coagulómetro MDA 180 (Organon Teknika, Cambridge, UK), usando os factores V, VIII e IX de plasma deficiente (Diagnostica Stago). O grupo negativo APCR, composto por 50 mulheres selecionadas aleatoriamente de diferentes séries de testes de Coatest fornecendo a base para o grupo controle na comparação de dados entre diferentes variáveis.
Resultados para os níveis dos fatores V, VIII e IX foram expressos como níveis percentuais (%), e as faixas de referência utilizadas estão atualmente em uso clínico no Laboratório de Hematologia, UCHG. Cada execução foi controlada pela utilização de um controlo normal (MDA verify 1, Biomerieux) e anormal (controlo de coagulação A, Technoclone GmbH).
2.8. Análise Estatística dos Resultados Adversos da Gravidez no Grupo Observado nas 907 Mulheres Incluídas no Estudo
Os dados foram recolhidos no Departamento de Maternidade da UCHG. O número e tipo de resultados de gravidez estudados foram analisados utilizando o software SPSS versão 17.0. O teste Pearson Chi Square foi utilizado para comparar o grupo APCR-positivo e o grupo APCR negativo para analisar as mutações trombofílicas e a gama de resultados adversos associados a cada grupo. O teste Pearson Chi-Square foi usado para comparar o número e tipo de resultados adversos de gravidez no grupo APCR herdado versus adquirido. O SPSS foi utilizado para analisar os níveis dos fatores de coagulação V, VIII e IX utilizando o teste estatístico Kruskal-Wallis.
2,9. Critérios para Diagnóstico de Resultados Adversos
PET-BP (Pressão arterial) ≥140/90 mmHg, +1 proteinúria e edema. PIH-BP ≥140/90 sem proteinúria de acordo com o Jornal Oficial da Sociedade Internacional para o Estudo da Hipertensão Arterial na Gravidez. A IUGR é definida como o crescimento fetal inferior ao 5º percentil para a idade gestacional. LBW é definido como um peso inferior a 2500 g (até 2499 g inclusive), independentemente da idade gestacional.
3. Resultados
Identificamos 15,4% (𝑛=140) da coorte do estudo (𝑛=907) como APCR positivo com testes de Coatest adquiridos e/ou herdados. Os fatores V, VIII e IX apresentaram correlação positiva com um fenótipo adquirido de APCR. Os níveis para cada fator nos grupos APCR positivo (herdado) e APCR-positivo (adquirido) e APCR-negativo são mostrados na Tabela 2 e Figura 1. Os níveis dos fatores V, VIII e IX no grupo APCR adquirido foram significativamente maiores em comparação com o grupo controle normal. As médias foram fator V 131,5 IU/dL versus 114,6 IU/dL para o grupo controle, fator VIII 128,7 IU/dL versus 111,9 IU/dL no grupo controle e fator IX 114,8 IU/dL versus 106,9 IU/dL no grupo controle.
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(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
(a) Gráfico comparando os níveis de VF em diferentes grupos dentro do estudo, (b) gráfico comparando os níveis de FVIII em diferentes grupos dentro do estudo, e (c) gráfico comparando os níveis de F IX em diferentes grupos dentro do estudo.
Noventa e dois sujeitos (66%) do grupo APCR positivo tinham mutações trombofílicas comuns, 32% dos quais tinham a mutação FVL. Um total de 𝑛=116 mutações foram identificadas neste grupo, 68 sujeitos tiveram uma mutação, 23 tiveram duas mutações, 1 sujeito teve três mutações, e quarenta e oito sujeitos não tiveram nenhuma das mutações conhecidas rastreadas.
Com a APCR positiva adquirida (sem FVL) (𝑛=105), 70 mutações foram distribuídas entre 61 sujeitos que tiveram uma ou mais destas mutações. Dentro do grupo APCR negativo (𝑛=31), 18 sujeitos tiveram uma mutação. A distribuição das mutações trombófilas está resumida na Tabela 3.
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| (*1) 𝑛=140 são sujeitos com APCR total (adquirido +modificado). (*2) 𝑛=105 são sujeitos com APCR adquirido, sem FVL herdado. (*3) 𝑛=31 são sujeitos com APCR negativo, testados de 767. 𝑛: Número de sujeitos; ht: Heterozigotos; hom: Homozigotos; H: Haplótipo. Subjetos identificados com mais de uma mutação simultaneamente: No grupo total APCR, (herdados mais adquiridos) Tiveram 13 indivíduos com MTHFR+FVL; 1 indivíduo com MTHFR + FVL + Cambridge; 7 indivíduos com MTHFR + HR2; 1 indivíduo com protrombina G20210A + HR2; e 1 sujeito com protrombina G20210A + MTHFR; no grupo adquirido APCR, tiveram 7 sujeitos com MTHFR+HR2; 1 sujeito com protrombina G20210A + HR2; 1 sujeito com protrombina G20210A + MTHFR. |
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Frequências de desfechos adversos nos grupos APCR positivo e APCR negativo foram muito semelhantes em 35,7% e 34,2%, respectivamente (Tabela 4). A comparação dos resultados adversos da gravidez e das mutações trombófilas está resumida na Tabela 5. A PIH mostrou associação estatística significativa (𝑃<0,05) com Cambridge e protrombina G20210A. LBW mostrou associação estatística significativa (𝑃<0,05) com FC2 e MTHFR.
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| NA: não são computadas estatísticas porque não há IUGR nos grupos MTHFR e HR2. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discussão
A frequência da APCR tem sido relatada como aproximadamente 5% na população caucasiana geral . Isto varia de 1% a 15% em diferentes países com uma frequência de 3% reportada na Itália e Espanha e uma frequência de 15% reportada no Norte da Suécia . A APCR na população em geral e durante a gravidez é relatada como sendo mais frequentemente causada pela mutação FVL , APCR herdada.
Relatos universais mostraram, entretanto, que entre 5 e 10% da APCR em caucasianos não envolve a FVL, e a causa da APCR positiva nestes casos não é conhecida . Em nossa coorte de estudo (𝑛=907), a freqüência de APCR adquirida, determinada pelo método clássico do teste Coatest, de 11,5%, foi substancialmente maior do que a freqüência de APCR herdada identificada pelos testes Coatest modificados, 3,9%. De Visser et al. demonstraram que uma APCR alterada na ausência de FVL confere um risco 2,5 vezes maior de trombose venosa.
Neste estudo, foi demonstrada uma correlação estatística significativa do fenótipo adquirido da APCR com os Fatores V, VIII e IX. Estudo adicional seria necessário para determinar a interação dos fatores de coagulação para caracterizar melhor este fenótipo adquirido de APCR no início da gravidez. O APCR adquirido pode ser o resultado de uma série complexa de reações que dão uma degradação defeituosa destes fatores de coagulação mediada pelo APC. Por sua vez, um aumento destes fatores de coagulação no início da gravidez pode causar um desequilíbrio na cascata de coagulação e levar a danos vasculares e endoteliais durante o implante e a placentação. Isto tem o potencial de causar infartos placentários e altos níveis de deposição de fibrina, que tem sido previamente associada à APCR. O aborto espontâneo pode ocorrer em resposta a um aumento do desequilíbrio da coagulação, e se houver outros fatores trombóticos, incluindo mutações trombofílicas, interagindo simultaneamente quando o sujeito está além da 20ª semana de gravidez, o dano pode evoluir para PET ou PIH.
Mutações no gene FV excluindo FVL, particularmente nos outros sítios de clivagem do FV, Arg306 e Arg679, têm o potencial de contribuir para o fenótipo APCR . O haplótipo (H) R2 também tem sido associado ao APCR leve quando encontrado em combinação com o FVL . Houve uma série de outras mutações identificadas no gênero FV; entretanto, uma população grávida maior precisaria ser estudada para determinar se essas mutações contribuem significativamente para a APCR nas populações caucasianas . A trombofilia durante a gravidez tem sido ligada a outras mutações além daquelas localizadas no gene FV, incluindo a protrombina G20210A e o MTHFR-C677T . Neste estudo, identificamos mutações trombofílicas em 66% do nosso grupo positivo APCR (adquirido mais herdado) (𝑛=140). Um desses sujeitos teve 2 mutações no gene FV, FVL e FV Cambridge-G1091C, em dois locais de clivagem do FV para APC . Este sujeito também foi encontrado neste estudo como portador da mutação do MTHFR-C677T. Estudos anteriores estabeleceram que a presença de mais de um polimorfismo protrombótico está associada a um risco substancial de TEV com um alto risco de resultados adversos na gravidez. Além disso, mais recentemente, a mutação do MTHFR-C677T tem sido implicada na pré-eclâmpsia. A alta frequência do MTHFR-C677T nos grupos APCR negativos e APCR positivos pode estar na base de diferenças específicas da população. As discrepâncias nos resultados adversos da gravidez associados ao MTHFR-C677T podem ser explicadas pelas diferenças de frequência específica entre as populações .
Identificamos também protrombina G20210A em 3 sujeitos no grupo APCR adquirido sem a presença da mutação FVL, com o haplótipo (H) HR2 e MTHFR-C677T identificado tanto no grupo APCR positivo (adquirido mais herdado) quanto no grupo APCR negativo.
As amostras negativas de APCR (𝑛=31) testadas para mutações trombófilas neste estudo para representar a coorte normal são um pequeno número de amostra, e isso pode ser uma falha em nosso estudo, resultando em diferenças não significativas. O teste de um número maior de APCR negativos teria dado resultados mais confiantes. Isto pode ser algo a ser investigado em um estudo futuro.
Embora alguns estudos anteriores tenham mostrado uma associação de APCR positiva com PET, IUGR e IUFD neste estudo, não houve diferença significativa na frequência de resultados adversos entre os grupos APCR positivos e APCR negativos. Isto parece ser consistente com outros estudos anteriores. No entanto, a frequência geral de resultados adversos da gravidez nos grupos positivos de APCR faz deste grupo de estudo “um grupo de alto risco”. Fatores ambientais como o tabagismo e o índice de massa corporal (IMC) que poderiam ter influenciado a taxa de APCR adquirida e a frequência dos desfechos adversos identificados não foram incluídos. Esta é uma limitação do estudo.
Em nosso grupo de estudo total, mutações trombofílicas incluindo FVL Cambridge e Protrombina G20210A parecem estar relacionadas à HPI, enquanto o haplótipo MTHFR-C677T e HR2 parecem estar associados ao LBW. Embora a APCR positiva por si só não pareça ser a causa de resultados adversos graves durante a gravidez, a APCR herdada pode, no entanto, ter um efeito na hipertensão quando está presente em combinação com outros fatores de risco trombofílicos conhecidos e desconhecidos agindo simultaneamente durante a gravidez.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Irish Health Research Board. Os autores agradecem às mulheres grávidas que consentiram em se envolver no estudo e às parteiras da ala do parto da UCHG. Os autores agradecem a Benoit Houeix pela sua contribuição na análise estatística incluída neste trabalho e também à Dra. D. Mongan, UCH, Galway, pela sua colaboração no fornecimento de informação sobre resultados adversos e análise de dados dos sujeitos incluídos no estudo.