Variações no ciclo Calvin-Benson: pressões de seleção e otimização?

O ciclo Calvin-Benson é a base da fixação do carbono em todos os organismos fotossintéticos. No entanto, sabe-se relativamente pouco sobre a medida em que o seu funcionamento varia entre espécies. Usando uma abordagem de perfil metabólico, foram descobertas diferenças nos níveis dos principais intermediários do ciclo Calvin-Benson entre as espécies C3 e C4. Estas diferenças nos grupos metabólicos foram observadas entre as espécies C3, assim como entre as plantas C3 e C4. Este trabalho levanta a interessante possibilidade de que a variação das pressões de seleção dos componentes do ciclo Calvin-Benson tenha levado à sua otimização independente entre as espécies.

Em 1954, Melvin Calvin, Andrew Benson e James Bassham publicaram a via metabólica utilizada para fixar o CO2 atmosférico – o ciclo Calvin-Benson (Bassham et al., 1954). Suas descobertas fundamentais foram baseadas na alimentação da alga Chlorella com CO2 marcado com 14C e no rastreamento da rotulagem dos metabólitos ao longo do tempo (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). Eles descobriram que o ciclo é composto por três fases: primeiro, a enzima ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco) fixa o CO2 utilizando ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) como aceitador, produzindo duas moléculas de 3-carbono, 3-fosfoglicerato (3-PGA). Em segundo lugar, ATP e NADPH gerados durante a cadeia fotossintética de transporte de elétrons (as reações dependentes da luz da fotossíntese) são usados para fosforilato e subsequentemente reduzem o 3-PGA a triose-fosfato (triose-P). Em terceiro lugar, o RuBP aceitador de CO2 é regenerado através de uma série de reacções (Caixa 1). A maioria das enzimas envolvidas neste ciclo foi descoberta mais cedo ou logo após (Horecker et al. 1951; Racker et al., 1953; Mayoudan et al., 1957). Desde então, tem sido geralmente assumido que a operação do ciclo Calvin-Benson é altamente conservada entre diferentes espécies de plantas.

Box 1.

O ciclo Calvin-Benson

O ciclo Calvin-Benson é composto de três fases: (1) fixação do carbono, (2) redução e (3) regeneração do aceitador de CO2.

A carboxilação é obtida através da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco), que fixa o CO2 utilizando ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) como aceitador e ao fazê-lo produz duas moléculas de 3-carbono de 3-fosfoglicerato (3-PGA). O 3-PGA é subsequentemente fosforilado por fosfoglicerato quinase (PGK) e reduzido a triose fosfato (triose-P) por gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) na fase de redução. O ciclo utiliza 3 ATP e 2 NADPH por molécula de CO2 fixo. O triose-P pode ser transportado para fora do cloroplasto para produzir sacarose no citosol. A frutose 1,6-bisfosfato aldolase (FBP ald) pode converter o triose-P em fructose-6-fosfato (F6P), o intermediário utilizado para produzir amido. Também, o triose-P pode ser convertido em RuBP em uma série de reações de regeneração para a fixação de mais moléculas de CO2.

A abreviações: fructose-1,6-bisfosfato (FBP), fructose-1,6-bisfosfatase (FBPase), eritrose-4-fosfato (E4P), sedoheptulose 1,7-bisfosfato aldolase (SBP ald), sedoheptulose-1,7-bisfosfato (SBP), sedoheptulose-1,7-bisfosfatase (SBPase), sedoheptulose-7-fosfato (S7P), transketolase (TK), ribose-5-fosfato (R5P), xilulose-5-fosfato (Xu5P), ribose-5-fosfato isomerase (RPI), ribulose-5-fosfato epimerase (RPE), ribulose-5-fosfato (Ru5P), fosforibulokinase (PRK). Enzimas que catalisam reacções irreversíveis são realçadas por uma pesada seta em negrito (i.e. Rubisco, FBPase, SBPase e PRK).

Na grande maioria das plantas terrestres, juntamente com as reacções dependentes da luz da fotossíntese, o ciclo Calvin-Benson é conduzido principalmente nas células mesofílicas das folhas. Entretanto, Rubisco discrimina mal entre CO2 e O2 (Bowes et al., 1971) e a fixação de uma molécula de O2 ao invés de CO2 resulta em fotorrespiração – um caminho de recuperação energeticamente caro para recuperar RuBP. Após a concentração atmosférica de CO2 ter caído drasticamente há 2,3 bilhões de anos (Bekker et al., 2004), dois mecanismos de concentração de carbono evoluíram, limitando a quantidade de fotorrespiração. Essas modificações no processo fotossintético básico, fotossíntese C4 e metabolismo ácido crassuláceo (CAM), cada uma delas surgiu várias vezes (Sage et al., 2011). A fotossíntese C4 envolve a separação espacial da fotossíntese de modo que componentes tanto das reações dependentes da luz quanto do ciclo Calvin-Benson ocorrem em células de mesofila e de bainha de feixe (Quadro 2). Apesar das diferenças na localização anatômica da fixação de carbono, até agora pouco se sabia sobre como o funcionamento do ciclo Calvin-Benson pode ser diferente em plantas C4 versus plantas C3 e também entre plantas C3.

Box 2.

O mecanismo de concentração de carbono em plantas C4

Em 1966, Hal Hatch e Roger Slack descobriram a fotossíntese C4 (Hatch and Slack, 1966), que envolve um mecanismo de concentração de carbono adicionado à via regular de fixação de carbono C3. Eles usaram a rotulagem 14C para demonstrar que o CO2 nas folhas da cana de açúcar foi primeiramente fixado em ácido 4-carbono, ao invés de 3-fosfoglicerato (3-PGA) como nas plantas C3. As plantas C4 utilizam a carboxilase fosfoenolpiruvada (PEPC) como sua enzima fixadora inicial de carbono nas células mesofílicas. O ácido 4-carbono (malato ou aspartato, dependendo do tipo de fotossíntese C4) produzido nas células da mesofila entra então nas células da bainha do feixe, onde é descarboxilado e o CO2 é liberado. Este mecanismo de concentração de carbono permite que Rubisco aja quase exclusivamente como carboxilase durante o ciclo Calvin-Benson dentro das células da bainha do feixe. Além de uma reconfiguração das enzimas metabólicas existentes, a via C4 requer o desenvolvimento de anatomia especializada da folha (anatomia Kranz) que inclui um aumento no espaçamento das veias e no tamanho das células da bainha do feixe. Classicamente, três tipos diferentes de fotossíntese C4 foram reconhecidos, denominados após a enzima primária responsável pela reação de descarboxilação nas células da bainha do feixe: tipo NAD-ME, NADP-ME ou PEPCK. Abreviaturas: anidrase carbónica (CA), oxaloacetato (OA), malato desidrogenase dependente de NADP (NADP-MDH), malato (M), enzima málica dependente de NADP (NADP-ME), piruvato (Pyr), piruvato, ortofosfato dikinase (PPDK), fosfenoenolpiruvato (PEP).

Variação nos metabolitos do ciclo Calvin-Benson entre espécies

O ciclo Calvin-Benson é sem dúvida uma das vias bioquímicas mais críticas da Terra, como a via de assimilação de carbono nas plantas – o coração da fotossíntese. Mas será que todas as espécies de plantas percorrem este caminho da mesma forma? Arrivault et al. (2019) traçam o perfil da abundância de metabolitos do ciclo Calvin-Benson a partir de cinco plantas C3 (incluindo Arabidopsis e várias culturas importantes como arroz, trigo e mandioca) e quatro plantas C4 (incluindo milho). Os metabolitos totais foram extraídos de folhas maduras e medidos por cromatografia líquida de fase reversa acoplada à espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS). Para uma quantificação fiável, as amostras foram perfuradas com padrões metabólicos internos marcados com isótopos; o 3-PGA foi quantificado enzimaticamente. Os perfis metabólicos das diferentes espécies de plantas foram comparados usando análise dos componentes principais.

Crivault et al. (2019) descobriram diferenças substanciais nos perfis metabólicos dos intermediários do ciclo Calvin-Benson entre as cinco espécies C3 que estudaram. Os intermediários que mais variaram incluíram os níveis absolutos de 3-PGA, triose-P, ribulose-5-fosfato (Ru5P) e xilulose-5-fosfato (Xu5P). Os níveis relativos de RuBP comparados com os níveis de intermediários envolvidos na regeneração do RuBP foram variáveis entre as espécies. Além disso, os autores demonstraram variabilidade nos níveis relativos de pares metabólicos como o fructose-1,6-bisfosfato (FBP) e o fructose-6-fosfato (F6P), que estão ligados através da reação irreversível da FBPase; e no par metabólico sedoheptulose-1,7-bisfosfato (SBP) e sedoheptulose-7-fosfato (S7P), que estão irreversivelmente interconvertidos pela SBPase. Na maioria dos casos, as cinco espécies de C3 estão claramente separadas umas das outras na análise dos componentes principais. A medida em que se separaram dependeu de se os dados foram normalizados para peso fresco, teor de clorofila ou teor de proteínas. A variação destes intermediários dentro das cinco espécies C3 aponta para diferenças na forma como as plantas correm o mesmo caminho de fixação de carbono. Esta informação tem consequências nas estratégias que visam melhorar a fotossíntese. Por exemplo, a SBPase pode limitar a taxa de fotossíntese (Zhu et al., 2007) e a superexpressão pode aumentar a eficiência fotossintética (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Assim, a alteração da atividade de uma única enzima no ciclo Calvin-Benson pode impactar a taxa de fotossíntese e, posteriormente, a biomassa e o rendimento. No entanto, sabe-se que a eficácia desta abordagem varia de espécie para espécie. A variação pré-existente dos níveis dos metabólitos da SBP e S7P entre as espécies C3 relatadas por Arrivault et al. (2019) é, portanto, importante e pode fornecer uma visão da resposta variável da fotossíntese ao aumento das quantidades de SBPase.

Desde que o mecanismo de concentração de carbono das plantas C4 limita a fotorrespiração, foi talvez menos surpreendente que o primeiro produto da fotorrespiração, 2-fosfoglicolato (2-PG), tenha sido menos abundante nas espécies C4 do que nas espécies C3. Além disso, as plantas C4 tinham níveis mais baixos de RuBP do que as plantas C3, consistente com o seu menor investimento em Rubisco. Entretanto, mesmo quando os níveis de 2-PG e RuBP foram omitidos do conjunto de dados, os níveis de metabólitos C3 e C4 foram quase sempre separados na análise dos componentes principais. Essas diferenças foram consistentes, independentemente de os dados terem sido normalizados para peso fresco, teor de clorofila ou teor de proteínas, e assim as mudanças indicam que as enzimas responsáveis pela geração dos metabólitos estão realizando a catálise em diferentes taxas em diferentes espécies. Os autores cunham o termo ‘modo de operação’ do ciclo Calvin-Benson para descrever essas diferenças – de tal forma que o ciclo está operando de forma diferente entre as espécies mesmo que as mesmas enzimas estejam envolvidas, levando às alterações observadas nos níveis relativos dos intermediários. Portanto, propõem que as diferenças no ciclo Calvin-Benson entre plantas C3 e C4 são mais amplas do que uma simples recolocação espacial para agrupar células da bainha nesta última, e envolvem adaptação no modo de operação do ciclo.

Perspectivas futuras

Estabelecendo que o modo de operação do ciclo Calvin-Benson pode variar é interessante, especialmente considerando que a estrutura do caminho (em termos de enzimas envolvidas e sua seqüência de reação dentro do ciclo) tem sido altamente conservada. No entanto, ao longo dos milhões de anos desde o primeiro aparecimento do ciclo, a proporção de O2 para CO2 na atmosfera mudou drasticamente. Pensa-se que estas mudanças contribuíram para que algumas espécies de plantas desenvolvessem mecanismos de concentração de carbono. Os autores propõem agora que níveis baixos de CO2 em combinação com condições ambientais específicas podem ter levado ao desenvolvimento de diferentes modos de operação do ciclo Calvin-Benson. Assim, a variação nos perfis metabólicos observados pode refletir pressões distintas de seleção sobre como o ciclo Calvin-Benson é regulado em diferentes linhagens de plantas. A abordagem utilizada pelos autores para analisar os intermediários do ciclo Calvin-Benson poderia agora ser aplicada a mais espécies, e isto seria particularmente interessante se estes abrangessem uma gama mais ampla de famílias de plantas em diversos ambientes. Isto poderia revelar se a variação segue estritamente os táxons filogenéticos ou ambientes específicos aos quais as plantas se adaptaram.

As plantas C4 analisadas em Arrivault et al. conduzem todas a fotossíntese C4 tipo NADP-ME. Assim, uma linha promissora de estudo adicional seria explorar se mudanças similares nos intermediários do ciclo Calvin-Benson são observadas nos três tipos de metabolismo C4, ou se são específicas do tipo NADP-ME.

Este trabalho é um excelente ponto de partida para descobrir como estes diferentes modos de ciclo Calvin-Benson são controlados a nível molecular. Enquanto o perfil metabólico permite uma abordagem imparcial para avaliar a variação nos níveis de intermediários entre diferentes espécies, as causas subjacentes a essas diferenças ainda não foram determinadas. A variação entre as espécies pode resultar de diferenças na expressão gênica e subsequentes atividades proteicas, variação na sequência de aminoácidos com impacto na cinética, ou regulação pós-traducional das enzimas. Notavelmente, quase todas as enzimas do ciclo Calvin-Benson estão sujeitas a pelo menos alguma forma de regulação redox, principalmente através do sistema de thioredoxina (TRX)/ferredoxina (Fd) (Buchanan e Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). A integração desses dados de transcrição, abundância de proteínas e atividade enzimática aos níveis metabólicos pode revelar a base molecular da variação. Além disso, as variações observadas nos pools metabólicos também podem estar relacionadas às demandas por certos intermediários, particularmente aqueles que são retirados do ciclo Calvin-Benson. Por exemplo, o fluxo através do ciclo pode ser influenciado pelas vias de saída para permitir a síntese de amido (via F6P), sacarose e isoprenoides (via triose-P), aminoácidos através da via shikimate (via E4P), assim como tiamina e nucleotídeos (via R5P) (Raines, 2011).

Arrivault et al. (2019) relatam variações interessantes na forma como os componentes do ciclo Calvin-Benson operam em diferentes espécies de plantas. Isto certamente catalisará mais estudos sobre como as plantas adaptaram este caminho fundamental e antigo de fixação de carbono a diferentes ambientes.