Djur
S. purpuratus hölls i konstgjort havsvatten vid 14 °C. L. anatina samlades in i juni 2016 i Xiangshan våtmarker, Xiangshan District, Hsinchu City, Taiwan (GPS-koordinater 24.770779, 120.910742 E), transporterades till laboratoriet på is och dissekerades sedan omedelbart.
Konstruktioner och plasmider
För att bestämma den enzymatiska aktiviteten hos SpAIDLs och LaAIDLs skapades respektive bakteriella expressionsvektorer pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID för SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 och HsAID. De öppna läsramarna för varje SpAIDL amplifierades från genomiskt DNA genom PCR med hjälp av Phusion-polymeras och primers som innehåller SpeI- och XhoI-restriktionsplatser (kompletterande tabell 1). PCR-produkterna smältes med SpeI och XhoI (New England Biolabs) och infogades i NheI/XhoI-platserna i pASK-TadA (en gåva från Nina Papavasiliou, Rockefeller University, New York) och ersatte den öppna läsramen för TadA. För SpAIDL9 ändrade denna kloningsstrategi den tredje aminosyran från fenylalanin till serin, och denna F3S-mutation återställdes till F3 med hjälp av Quikchange mutagenesekit (Stratagene) med primers SPA9S3FT/SPA9S3FB (kompletterande tabell 1). HsAID amplifierades från en plasmid som innehåller mänsklig AID i full längd (pCDF-AID, en gåva från dr Nina Papavasiliou, Rockefeller University, New York). Kloningsstrategin ändrade den andra aminosyran från aspartat till alanin, och D2A återställdes till D2 med hjälp av Quikchange mutagenesekit (Stratagene) med primers hAIDA2DT/hAIDA2DB (kompletterande tabell 1). Den tomma pASK genererades genom NheI/XhoI-spjälkning av pASK-TadA, fyllning av överhäng med Klenow-polymeras och ligering med T4-dna-ligas (Thermo Scientific). De öppna läsramarna för varje LaAIDL amplifierades från L. anatina cDNA och klonades in i kloningsvektorn pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). De öppna läsramarna för LaAIDLX skars av med SpeI och XhoI (New England Biolabs) och klonades in i XbaI/XhoI-platserna i pASK_V5-SpAID4a (beskrivs nedan) och ersatte insatsen för SpAID4a. Det bör noteras att de klonade fragmenten innehåller de ursprungliga stoppkodonerna i sina 3′-ändar så att det uttryckta proteinet inte innehåller en V5-tagg.
Expressionskonstruktionerna för mutanterna av den aktiva platsen hos SpAIDL1 och LaAIDL1 (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, och LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) genererades genom platsriktad mutagenes från respektive vildtypsplasmider (eller enskilda mutanter) med hjälp av Quikchange mutagenesekit (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB för SpAIDL1 RQ), eller genom konventionell PCR med hjälp av 5′-fosforylerade primers (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB för den andra uppsättningen förändringar i SpAIDL1 RQAA, och LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P och LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P för SpLaAIDL1 RQRQ), följt av DpnI-desintroduktion, ligering för att cirkularisera produkterna, och transformation till kompetent E. coli.
För att övervaka nivån av rekombinant proteinuttryck i E. coli skapades de bakteriella uttryckskonstruktionerna pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID. pASK_V5 genererades genom att annealing av oligonukleotiderna pASK_V5F/pASK_V5R (kompletterande tabell 1) som innehåller V5-tagg-sekvensen och ligering av dem till NheI/SalI-platser i pASK-TadA. Plasmiderna pASK-SpAIDLX/LaAIDLX användes som mallar för att amplifiera respektive cDNA utan stoppkodon, med hjälp av Phusion-polymeras och de primers som förtecknas i den kompletterande tabellen 1, och klonades i NheI/XhoI-platserna (för SpAIDLX- och HSAID-fragmenten) eller XbaI/XhoI-platserna (för LaAIDLX-fragment) i pASK_V5. HsAID amplifierades från pASK-hAID. Sekvenserna för både SpAIDL9 och HsAID ändrades återigen av denna kloningsstrategi och ändrades tillbaka till de korrekta sekvenserna enligt beskrivningen ovan.
Preparering av genomiskt DNA
Genomiskt DNA från både S. purpuratus och L. anatina renades med hjälp av gDNA Spin Kit Tissue (Bioman) enligt tillverkarens anvisningar. Cirka 1 × 106 coelomocyter från S. purpuratus och 100 mg vävnad från L. anatina tillsattes i separata mikrocentrifugeringsrör, homogeniserades i 200 µl buffert GT (Bioman) innehållande 200 mg proteinas K och inkuberades i 30 minuter vid 60 °C för att fullständigt lysera cellerna. Efter tillsats av 200 µl BG-buffert (Bioman) vortexades proverna och inkuberades i 20 minuter vid 70 °C. Därefter tillsattes 200 µl etanol och hela provet laddades på en GD-spinnkolonn (Bioman). Tvättning med 400 µl WI-buffert (Bioman) och 600 µl tvättbuffert utfördes genom centrifugering vid 10 000×g i 30 s. Detta följdes av eluering av genomiskt DNA med 100 µl elutionsbuffert (10 mM Tris pH = 8,0) som förvärmts till 60 °C.
RNA-beredning och cDNA-syntes
S. purpuratus coelomic vätska drogs med en spruta genom det periostomala membranet och blandades omedelbart med en lika stor volym CMSFW-EI (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM imidazol). Coelomocyterna snurrades av och återuppsattes i 800 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman). Ösofagus, tunntarm, tjocktarm och gonader från S. purpuratus och pedikeln, digestionscecum, gonad och tarm från L. anatina dissekerades från enskilda djur. Små bitar av de fasta vävnaderna från S. purpuratus och L. anatina lades till 200 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman), och proverna homogeniserades i en Bullet Blender (Next Advance) med hjälp av 0,5 mm ZrO-pärlor. Olösligt skräp snurrades av och supernatanten överfördes till nya rör som innehöll 600 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) och 200 μg glykogen som bärare. Totalt RNA renades sedan enligt tillverkarens protokoll. För att avlägsna resterande gDNA och andra föroreningar bearbetades sedan RNA från S. purpuratus ytterligare med hjälp av antingen Turbo DNA-free kit (Ambion) eller RNeasy mini kit (Qiagen). Turbo DNA-free-kitet (Ambion) användes enligt tillverkarens protokoll, förutom att extra MgCl2 (2,5 mM) och CaCl2 (1 mM) tillsattes för DNasnedbrytningen. RNeasy mini kit (Qiagen) användes enligt tillverkarens protokoll.
Ungefär 250-500 ng RNA från S. purpuratus och L. anatina från varje vävnad omvandlades till cDNA med hjälp av ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) respektive ToolsQuant II Fast RT Kit (Biotools). I båda fallen användes slumpmässiga hexamerer och tillverkarens instruktioner följdes.
Snabb amplifiering av cDNA-ändar
5′- och 3′-ändarna av SpAIDL9-transkriptionerna amplifierades med hjälp av SMARTer RACE-kittet (Clontech) och de genspecifika primrarna SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 (se kompletterande tabell 2) enligt tillverkarens anvisningar. PCR-produkter som innehåller 5′- och 3′-ändarna av transkriptionerna klonades in i kloningsvektorn pJET1.2/blunt cloning vector (Thermo Scientific), och enskilda kloner sekvenserades helt och hållet.
Sekvensanalys av SpAIDL-generna
Genomiskt DNA från tre S. purpuratus-individer (Sp105, Sp111, Sp112) användes som mallar för att amplifiera de öppna läsramarna för SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9 med hjälp av Phusion-polymeras och de primers som anges i kompletterande tabell 2. PCR-produkterna klonades in i kloningsvektorn pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Plasmiderna renades med hjälp av Tools mini plasmidkit (Biotools) och skickades till en kommersiell tjänst (Genomics Taiwan) för sekvensering med hjälp av antingen pJET1.2 forward eller pJET1.2 reverse primers.
Minst åtta sekvenser samlades in för varje gen från varje sjöborre, och primersekvenserna exkluderades före sekvensjusteringarna. Nukleotidsekvenserna för varje gen anpassades först inom varje S. purpuratus med hjälp av CLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw), och de dominerande sekvenserna som motsvarar de två allelerna valdes sedan ut för att sedan jämföras mellan enskilda sjöborrar.
Genuttrycksanalys
Komplementärt DNA från tre enskilda S. purpuratus (Sp146, Sp147, Sp148) och två enskilda L. anatina (La1 och La3) användes som mallar för att testa uttrycket av antingen SpAIDL1, 2, 3, 4a och 9 eller LaAIDL1 och 2 genom kvantitativ PCR. Varje qPCR-reaktion (10 μl) innehöll 5 μl Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), primers (0,1 μM) (se kompletterande tabell 3) och 1 μl av mallen, och för varje prov gjordes två tekniska replikat. qPCR-reaktionerna utfördes i ett 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems) med ett inledande denatureringssteg vid 95 °C i 20 sekunder följt av 40 cykler om 3 sekunder vid 95 °C och 30 sekunder vid 60 °C. Standardkurvor användes för att bestämma genuttrycksnivåerna och hushållsgener (Sp18S för S. purpuratus och LaRPL39 för L. anatina) användes för normalisering.
Bakteriell infektionsmodell
Vibrio diazotrophicus odlades i flytande kulturer i Difco marin buljong (Becton Dickinson) vid 30 °C och 250 rpm över natten. Sex friska sjöborrar valdes slumpmässigt ut och delades in i två grupper, en försöksgrupp och en kontrollgrupp. Alikvot av coelomisk vätska (0,5 ml) togs från varje djur vid t = 0. Sjöborrarna i experimentgruppen injicerades med en suspension av levande Vibrio diazotrophicus i 200 µl sterilt artificiellt havsvatten där mängden bakterier justerades för varje sjöborre så att den motsvarade 106 celler/ml av den totala volymen coelomisk vätska. Kontrollgruppen injicerades med 200 µl sterilt havsvatten. Vid t = 6, 24 och 48 timmar togs 200 µl coelomisk vätska från varje djur i varje grupp. RNA extraherades från de coelomocyter som erhölls vid varje tidpunkt, och från proverna från t = 0 framställdes också genomiskt DNA. Primerparen för genuttrycksanalys (kompletterande tabell 3) testades först på de genomiska DNA-proverna för att säkerställa att de kan amplifiera respektive gen från varje individ, trots de anmärkningsvärda nivåerna av polymorfismnivåer i deras sekvens inom S. purpuratus-populationen (se fig. 1b). Kvantitativ RT-PCR (enligt beskrivningen ovan) användes för att mäta genuttrycksnivåerna med minst två tekniska replikat per prov. Expressionsvärdena normaliserades först till nivåerna av 18S i varje prov och sedan till värdena vid t = 0 för varje djur. Tre biologiska replikat användes för experiment- och kontrollgruppen, och alla datapunkter visas.
CDA-analyser med kanamycinresistensreporter
Ett optimerat protokoll för en allmänt använd analys för att mäta polynukleotid-CDA-aktiviteter26 användes. Plasmidet pTAC-Kan deaminasreporterplasmid som innehåller en L94P-punktmutation i KanR-genen och enskilda pASK-SpAIDLX/LaAIDLX-uttrycksvektorer transformerades sekventiellt till den UNG-bristfälliga BH156 E. coli-stammen. Den humana AID-uttrycksvektorn pASK-HsAID och den tomma pASK-vektorn fungerade som positiv respektive negativ kontroll. För deaminasbestämningen odlades minst åtta individuella kolonier för varje förmodat deaminas i LB-buljong (innehållande 50 μg/ml ampicillin (Amp), 50 μg/ml spectinomycin (Spc) och 17 μg/ml kloramfenikol (Cam)) tills den optiska tätheten vid 600 nm nådde 0,3. Varje kultur delades sedan i två delar. Medan IPTG (1 mM) tillsattes till båda, tillsattes anhydrotetracyklin (AHT) (0,2 μg/ml) endast till en av dem för att inducera uttrycket av SpAIDLX/LaAIDLX. Efter inkubation i 3 timmar vid 37 °C och 200 rpm spunnades kulturerna, tvättades med PBS och spreds på LB-plattor som innehöll antingen 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc och 17 μg/ml Cam eller 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc, 17 μg/ml Cam och 30 μg/ml kanamycin (Kan). Reversionsfrekvenserna beräknades som förhållandet mellan antalet KanR-kolonier och det totala antalet kolonier på Amp+Spc+Cam-plattan. Den relativa reversionsfrekvensen bestämdes sedan som förhållandet mellan reversionsfrekvenserna från ett par identiska bakteriekulturer, där KanR-transkriptionen inducerades med IPTG antingen i närvaro eller frånvaro av deaminasuttryck. För att bekräfta att KanR-kolonierna verkligen var ett resultat av DNA-deaminering renades pTAC-Kan-plasmiderna från flera kolonier och reversionen av stoppkodonet bekräftades genom DNA-sekvensering.
CDA-analyser med rpoB som rapportör
Ett optimerat protokoll för en allmänt använd analys för att mäta polynukleotid-CDA-aktiviteter35 användes. Enskilda pASK-uttrycksvektorer för de ryggradslösa deaminaserna transformerades separat till UDG-bristfälliga BH156 E. coli. Fyra ml kulturer av LB-medium innehållande 100 µg/ml Amp, 17 µg/ml Cam och 0,3 µg/ml AHT inokulerades med enskilda bakteriekolonier. Kulturerna odlades i 24 timmar vid 37 °C 230 rpm, alikvotar plattades ut på LB-agarplattor som innehöll 100 µg/ml Amp eller 100 µg/ml rifampicin och odlades vid 37 °C över natten. Kolonierna räknades och reversionsfrekvenserna beräknades som kvoten mellan antalet RifR-kolonier och antalet AmpR-kolonier från samma kultur. Kulturer som uttrycker HsAID eller innehåller den tomma pASK-uttrycksvektorn fungerade som positiv respektive negativ kontroll. Minst åtta kulturer per uttryckskonstruktion testades. För att fastställa identiteten hos mutationer i rpoB-genen från rifampicinresistenta kolonier utfördes koloni-PCR:er från 24 enskilda kolonier med hjälp av Phusion-polymeras och primerparet rpoBF/rpoBR. PCR-produkterna renades i gel och sekvenserades med hjälp av primern rpoBF. Mutationer identifierades genom jämförelse med WT-sekvensen (Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797).
Proteinuttryck av ryggradslösa deaminaser i E. coli
För att övervaka uttrycksnivån för SpAIDLX/LaAIDLX i deaminasanalyserna transformerades pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX till UNG-deficient BH156. Enskilda kolonier odlades i LB-buljong (innehållande 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc och 17 μg/ml Cam) tills den optiska densiteten vid 600 nm var 0,3. IPTG (1 mM) och AHT 0,2 (μg/ml) tillsattes till kulturen för att inducera proteinuttryck. Efter inkubation i 3 timmar (37 °C, 200 rpm) pelleterades kulturerna och tvättades med PBS. Pelleterna lyserades i 2x SDS-provbuffert, späddes tio gånger och separerades på ett par 10 % SDS-PAGE-geler. Medan den ena gelen färgades med Coomassieblått för att bedöma om lika stora mängder proteiner laddades, överfördes den andra gelen till PVDF-membran genom halvtorr överföring och V5-taggade deaminaser detekterades med hjälp av en primär antikropp mot V5 från mus (Abcam, ab27671) och ett pepparrotsperoxidaskopplat sekundärt kanin-anti-mus-antiserum (Jackson ImmunoReasearch). Kemiluminiscenta signaler visualiserades med Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) och röntgenfilm eller ett ChemiDoc Touch (BioRad) bildsystem. Obeskurna bilder av alla färgade proteingeler och Western Blots visas i kompletterande figur 5. Alla experiment med bakterieexpression utfördes i två exemplar.
Bioinformatik
Sekvensjämförelser med sjöborrens genom gjordes med hjälp av BLAST, BLASTP eller BLASTN på https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi eller www.echinobase.org med antingen standardparametrar eller med filtret för låg komplexitet avstängt. Flera sekvensanpassningar utfördes med hjälp av CLUSTALW och optimerades manuellt baserat på förutspådda sekundärstrukturella egenskaper. Fylogenetiska och molekylära evolutionsanalyser utfördes med hjälp av MEGA (version 7)36.
Datatillgänglighet
Sekvensdata som stödjer resultaten av denna studie har deponerats i Genbank med följande accessionskoder: SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).