Abstrakt
Ätiologin för neurodegenerativa sjukdomar tycks involvera känslighetsgener och miljöfaktorer. Giftiga metaller anses vara viktiga miljöföroreningar. Efter vår studie av ett fall av förbättring av multipel skleros (MS) på grund av avlägsnande av aluminium (Al) och andra giftiga metaller har vi undersökt det möjliga sambandet mellan Al-förgiftning och ND. Vi använde oss av långsam intravenös behandling med det kelatbildande medlet EDTA (kalciumdiskodiumetylendiamintetraättiksyra) (kelationstest) för att avlägsna Al och detekterade det i den urin som samlades in från patienterna under 12 timmar. Patienter som drabbats av MS utgjorde 85,6 % av den totala ND. Al fanns i 44,8 % av de fall som omfattade ND och friska patienter. Al-nivåerna var betydligt högre hos ND-patienter än hos friska personer. Vi visar här att behandling av patienter som drabbats av Al-belastning med tio EDTA-kelateringsbehandlingar (EDTA intravenös administrering en gång i veckan) kunde avsevärt minska Al-förgiftningen.
1. Introduktion
Exponering av mänskliga populationer för giftiga metaller kan resultera i skador på en rad olika organsystem.
En av de mest studerade giftiga metallerna, aluminium (Al), är inblandad i många sjukdomar. Al är en mycket riklig och allestädes närvarande miljö- och industritoxisk substans och ingår också i många livsmedelsprodukter, som är inblandad i skelett-, hematologiska och neurologiska sjukdomar . Al-toxicitet orsakas av störningar i homeostasen hos metaller som magnesium, kalcium och järn (Fe): Al efterliknar faktiskt dessa metaller i deras biologiska funktioner och utlöser många biokemiska förändringar . Al har framför allt en direkt genotoxicitet i primära mänskliga neurala celler och inducerar neurodegeneration genom en ökning av Fe-ackumulering och produktion av reaktiva syrgasarter (ROS) . Al-inducerad oxidativ skada på DNA har tidigare förknippats med neurodegeneration i olika regioner av råtthjärnan . Dessutom har Al3+ nyligen visat sig framkalla transportörmedierad degeneration av dopaminneuron i nematoden Caenorhabditis elegans.
Borttagning av giftiga metaller från människokroppen kan vara ett användbart verktyg för att undvika att många sjukdomar som är relaterade till metallintoxikation inleds eller fortskrider.
Metoderna som är användbara för att bestämma vissa metallhalter i biologiska prover i övervakningssyfte har utvecklats för några år sedan. Både toxiska och essentiella metaller har faktiskt analyserats i blod, urin och hår med atomabsorptionsspektroskopi . Successivt har metoder för analys av spårämnen i biologiska material från människor utvecklats, och induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS) ansågs vara att föredra för screening av flera grundämnen . Det verkar dock svårt att påvisa metallöverskott i blod och urin under andra förhållanden än akut metallförgiftning. I själva verket återspeglar ökningen av toxiska metaller i blodet endast en nyligen inträffad exponering för metaller . Efter akut exponering rör sig giftiga metaller snabbt från blodet till många vävnader, där de binds, t.ex. i det centrala nervsystemet (CNS). Det enda sättet att avlägsna ackumulerade giftiga metaller från mänskliga organ är att binda dessa metaller med hjälp av kelatbildare i syfte att bilda komplex som kan utsöndras i urinen. Nivåerna av giftiga metaller kan undersökas i urinprover som samlas in från patienter efter ”utmaning” med ett kelatbildande medel (”kelationstest”). Bland kända kelatbildare har vi valt kalciumdinatriumetylendiamintetraättiksyra (CaNa2EDTA eller EDTA), som administrerades intravenöst. Stabilitetskonstanter för aluminium och andra metaller av biokemiskt intresse med olika kelatbildare, inklusive EDTA, har tidigare studerats. Utvecklingen av en uppsättning metallkomplexkonstanter tjänade till att korrelera kemiska och funktionella egenskaper hos metallerna och tydde på att EDTA kunde mobilisera aluminium.
Förr i tiden har toxiska nivåer av Al förknippats med neurodegenerativa sjukdomar (ND). En möjlig koppling mellan Al och Alzheimers sjukdom har lyfts fram . År 1991 rapporterades behandling med låg dos intramuskulärt desferrioxamin (DFO), en trivalent chelator som kan avlägsna överskott av järn och/eller aluminium från kroppen, för att bromsa utvecklingen av Alzheimers sjukdom .
I detta arbete har vi beslutat att studera om Al var inblandat i neurotoxicitet. Vi utvärderade faktiskt Al-kroppsbelastningen hos patienter som drabbats eller inte drabbats av ND. Vi studerade också den möjliga minskningen av denna börda efter behandlingar med kelatbildaren EDTA.
2. Material och metoder
2.1. Studiedesign och patientrekrytering
Utav 471 konsekutiva försökspersoner som hade genomgått en läkarundersökning på en öppenvårdscentral valdes endast 211 ut och skrevs in i den här studien på grund av bevis på deras Al-belastning och följsamhet när det gäller att följa protokollet, t.ex. genom att de fick chelateringsbehandling en gång i veckan enligt personligt val. De ND som undersöktes i denna studie var multipel skleros (MS), amyotrofisk lateralskleros (ALS), Parkinsons sjukdom (PD) och Alzheimers sjukdom (AD). Många MS-patienter hade tidigare behandlats med konventionella läkemedel som används vid sådan patologi (t.ex. immunsuppressiva medel som mitoxantron och azathioprin, immunmodulerande medel med brett spektrum som glatirameracetat och interferon samt monoklonala antikroppar som rituximab och natalizumab). Vissa MS-patienter hade aldrig tidigare behandlats med läkemedel. Patienter som inte drabbats av kända sjukdomar (friska försökspersoner eller kontroller) samt patienter som drabbats av icke neurodegenerativa patologier (inte ND, vilket avser sjukdomar som inte klassificeras som ND som fibromyalgi) har också rekryterats. Vissa friska patienter som tidigare hade utsatts för giftiga metaller i miljön eller i arbetet föredrog att undersöka sin eventuella förgiftning genom att utvärdera förekomsten av sådana metaller i hårprover. De uteslöts därför från den aktuella studien. Alla patienter gav informerat samtycke till att delta i denna studie. De var mellan 18 och 75 år gamla.
2.2. Chelationstest och utvärdering av Al i urinen
Patienterna har genomgått chelationstestet för att visa eventuell Al-förgiftning. De uppmanades nämligen att samla in urinprover före och efter intravenös behandling med kelatbildaren EDTA (etylendiamintetraättiksyra, t.ex. kalciumdinatriumedetat, 2 g/10 mL utspädd i 500 mL fysiologisk koksaltlösning, Farmax srl, Brescia, Italien). EDTA administrerades långsamt intravenöst till patienterna (infusionen varade ca 2 timmar). Urinsamlingen efter kelatbildningen varade i 12 timmar. De prover som samlades in från denna samling omslöts noggrant i sterila flaskor och transporterades till toxikologilaboratoriet (Doctor’s Data Inc., St. Charles, IL, USA), där de har behandlats. Proverna syrades upp med certifierade metallfria syror. Uppslutningen skedde i ett mikrovågsöppningssystem med sluten behållare. För utspädning av proverna användes ultrarent vatten.
För att undvika kontaminering användes endast plastmaterial. All laboratorieutrustning (pipettspetsar, mätkolvar etc.) sänktes under minst 48 timmar i en 10 % (v/v) HNO3/etanol-lösning och sköljdes strax före användning med Milli-Q renat vatten. För att undvika kontaminering från luften utfördes alla steg i beredningen av prover och reagenser på en ren bänk av klass 100.
Testningen utfördes med hjälp av induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS) med användning av kollisions-/reaktionscellsmetoder i kombination med jonmolekylkemi, en ny tillförlitlig metod för att reducera interferenser. Metoden har nyligen använts för biomonitorering av 20 spårämnen i blod och urin från yrkesmässigt exponerade arbetstagare . Certifierade urinstandarder och interna standarder användes för kvalitetskontroll och för att validera resultaten. För att undvika den potentiellt stora felmarginal som kan bero på vätskeintag och provvolym rapporterades resultaten i mikrogram (μg) per g kreatinin. Kreatinin mättes med hjälp av högpresterande vätskekromatografi i omvänd fas och användes för att korrigera den totala volymen av urin Al för skillnader i den glomerulära filtrationshastigheten hos individer vid tidpunkten för stickprovet . Forskningsprogrammet med titeln ”Effekter av kelationsterapi med EDTA hos patienter som drabbats av patologier relaterade till exponering (akut eller kronisk) för giftiga metaller” har godkänts av det etiska åtagandet vid universitetet i Milano (Italien) (nummer 64/2014).
2.3. Klinisk utvärdering av patientens symtomförbättring vid MS
I avsaknad av ett diagnostiskt test som är specifikt för MS har det neurologiska samfundet antagit diagnostiska kriterier som ersattes under tiden . Magnetisk resonanstomografi (MRT), analys av cerebrospinalvätska och visuellt framkallad potential, som läggs till den kliniska diagnosen, har ansetts ha begränsningar i fråga om sensitivitet och specificitet. Efterhand har MRT fått större betydelse. Diagnosen av en förbättring av patientens symtom baseras dock för närvarande på kliniska kriterier, som minskning av neurologiska funktionshinder (parestesi, gångataxi, spasticitet, optikusneurit och blåsdysfunktion) och trötthet. Ibland är symtom på ALS, som pareser, muskelatrofi och dysartri, förknippade med MRT- och cerebrospinalvätskeavvikelser som är typiska för MS. Vi har faktiskt betraktat förbättringen av patientens symtom som återhämtning från klinisk funktionsnedsättning, till exempel arbetsförmåga, minskad spasticitet, fördröjning av återfall och/eller försvinnande av trötthet.
2.4. Effekten av EDTA-kelateringsbehandling på Al-intoxikation
Patienter som avslöjade Al-intoxikation (genom undersökning av dess nivåer i urinprover) utsattes för EDTA-kelateringsbehandling. EDTA (2 g i 500 ml fysiologisk koksaltlösning) infunderades intravenöst hos varje patient i cirka 2 timmar. Behandlingen gavs en gång i veckan och varade i tio veckor. I slutet av behandlingarna analyserades Al-nivåerna i urinen enligt tidigare beskrivning.
2.5. Dataanalys
Statistisk analys utfördes med hjälp av Microsoft Excel 2010 och IBM SPSS Statistics 20 (IBM Armonk, New York, USA). En logistisk regressionsanalys användes för att undersöka de relativa bidragen från flera variabler till operationsresultaten. ansågs vara signifikant.
3. Resultat
3.1. Patientens egenskaper
Figur 1 redovisar fördelningen av patienter som uppvisade Al-förgiftning.
Skema över de inskrivna försökspersonernas egenskaper.
De mest representerade patienterna som påverkades av ND var de som hade MS (85,6 % av totala ND). Vi jämförde faktiskt både gruppen MS-patienter och gruppen ND-patienter med gruppen friska patienter.
3.2. Al-intoxikation
Alla patienter uppvisade ingen Al-intoxikation före EDTA-utmaningen (data visas inte). Alla patienter som drabbats av ND uppvisade förgiftning av olika giftiga metaller (data visas inte). Efter utmaning med EDTA förekom Al i 44,8 % av fallen omfattande ND och friska patienter. Nivåerna av Al-förgiftning, som erhållits genom utvärdering av μg/g kreatininhalt av Al i urinproverna som samlats in efter den första intravenösa behandlingen med EDTA (kelationstest), redovisas i figur 2. Uppgifterna visar att Al-värdena var betydligt högre i urinproverna från SM- och ND-patienter än hos de friska patienterna.
Aluminium (Al)-nivåer utvärderade i urinproverna från undersökta personer, efter kelatortest (mörkt) och efter tio kelatbehandlingar med EDTA (ljust), uttryckta som medelvärde ± SEM av μg/g kreatinin. De undersökta personerna var friska patienter, patienter som drabbats av multipel skleros (MS) och patienter som drabbats av alla neurodegenerativa sjukdomar (ND). Al-nivåerna hos både MS- och ND-patienter var betydligt högre än hos friska försökspersoner efter kelationstest ( jämfört med friska). Efter kelatbehandlingar med EDTA var Al-nivåerna signifikant lägre än de som erhölls efter kelationstest (# jämfört med och ## jämfört med ).
3.3. Nyttan av EDTA-kelateringsbehandling
Effekten av EDTA-kelateringsbehandling redovisas även i figur 2. De patienter som har visat Al-förgiftning efter chelationstestet genomgick nämligen chelateringsbehandling (intravenös administrering av EDTA en gång i veckan). Efter tio terapier utvärderades Al-nivåerna i urinproverna ytterligare och jämfördes med de nivåer som erhölls efter kelationstestet. EDTA-administrationen visade sig vara betydligt effektiv när det gäller att avlägsna Al-belastningen, vilket framgår av figur 2. Våra resultat visade att minskningen av tiden för Al-förgiftning hade ett gott samband med förbättrade kliniska förhållanden hos patienterna. I själva verket presenterade de, i olika utsträckning, en minskning av neurologiskt handikapp och trötthet.
Noterbart är att effekten av EDTA-kelateringsbehandling var tydligare hos ND än hos friska patienter.
4. Diskussion
Toxiska metaller, bekämpningsmedel och fenoler betraktas som stora miljöföroreningar . Giftiga metaller klassificeras som icke biologiskt nedbrytbara ämnen, liksom plaster och tvättmedel, eftersom de inte bryts ned av mikroorganismer. De utgör en global hälsorisk eftersom de kan bidra till en rad olika sjukdomar. I detta sammanhang har Al (som är ett mycket reaktivt grundämne och en allestädes närvarande miljöförorening) förknippats med vissa sjukdomar . Osteomalaci är faktiskt en skelettsjukdom som är relaterad till toxiska effekter av Al, t.ex. fosfatbrist, försämrat Ca-upptag och dysfunktionell osteoblastproliferation . Al-exponering kan dessutom försämra absorptionen av Fe i tarmen, vilket främjar ett anemiskt tillstånd . Al kan dessutom spela en aktiv roll i de patogenetiska mekanismerna för neurologiska sjukdomar. Al har särskilt visat sig vara ansvarigt för kritiska neuropatologiska lesioner vid Alzheimers sjukdom och andra besläktade sjukdomar på grund av sin förmåga att tvärbinda hyperfosforylerade proteiner . Al har påvisats i amyloidfibrer i kärnorna av senila plack i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom . Närvaron av Al i biologiska system kan leda till en viktig prooxiderande aktivitet genom att främja superoxidgenerering genom Fentonreaktionen . På senare tid har man också föreslagit att Al ska avlägsnas hos patienter med Alzheimers sjukdom genom behandling med DFO . Framgångsrik behandling med DFO (både i låg och standarddos) har utförts för Al-överbelastning hos hemodialyspatienter . Dessutom har DFO visat sig kunna utöva skyddseffekter i hjärnvävnad hos möss mot Al-inducerade strukturella och metaboliska förändringar . Eftersom vissa patienter kan ha intolerans mot DFO eller utveckla DFO-biverkningar såsom allergiska reaktioner, neurologiska symtom eller uppenbara gastrointestinala störningar, beslutade vi emellertid att använda EDTA som kelatbildare. Chelatorn N-(2-hydroxietyl)etylendiamintriättiksyra (HEDTA), som liknar EDTA, har visat sig vara effektiv, även i förening med selen, mot Al-inducerad oxidativ stress i råtthjärnan .
Överhöjd urinutsöndring av Al och Fe har tidigare påvisats hos MS-patienter .
Vi har tidigare studerat fallet med en ung man som drabbats av MS, och som i några år har behandlats utan framgång med nuvarande behandlingsmetoder . Symtom som patienten avslöjade var subakut synförlust, diplopi och smärta vid ögonrörelser som de första symtomen på optikusneurit; störning av finmotoriken; parestesi och gångataxi; blåsdysfunktion; och betydande trötthet. Vi undersökte hans nivåer av giftiga metaller i urinen efter intravenös ”utmaning” med EDTA. Patienten uppvisade förhöjda nivåer av Al, Pb och Hg i urinen. Han utsattes faktiskt för behandling med EDTA två gånger i månaden. Under behandlingen uppvisade patienten med tiden förbättrade symtom som tydde på att MS hade avklingat. Han återfick synen och blåsfunktionen och parestesierna försvann liksom tröttheten. Eftersom den mest representerade toxiska metallen hos denna patient var Al, beslöt vi att undersöka det möjliga sambandet mellan Al-förgiftning och ND.
Våra resultat visar att Al-nivåerna som uppmättes i urinprover från patienter som drabbats av både MS som studerats separat och total ND som studerats var signifikant högre än hos friska patienter, vilket rapporteras i figur 2. Friska patienter uppvisade cirka 80 μg/g kreatinin, som genomsnittliga Al-nivåer, även om normalvärdena ligger på 35 μg/g kreatinin. Dessa uppgifter tyder på att Al-förgiftning inte nödvändigtvis är relaterad till uppkomsten av kliniska symtom på ND. Dessutom kan kontrollpatienter möjligen begränsa ytterligare Al-belastning genom neuroprotektiva eller antioxidativa mekanismer som saknas hos ND-patienter. Kliniska utvärderingar av varje patient tyder på att det finns ett viktigt samband mellan Al-förgiftning och försämrade rörelser, parestesi, ataxi och andra symtom hos personer som drabbats av ND. De patienter som uppvisade de högsta värdena av Al i urinprovet uppvisade också de allvarligaste sjukdomsdragen på klinisk nivå. Invändningen att det kan vara farligt att mobilisera (med hjälp av kelatbildare) Al från relativt säkra platser, t.ex. ben, och deponera denna mycket neurotoxiska metall i CNS, motsägs av att patienter som drabbats av ND hade en Al-belastning (som är ansvarig för sjukdomens patogenes) i CNS före kelatbildningen. Dessutom avlägsnas de komplex som bildas av giftiga metaller med kelatbildare väl av njurarna. Nyligen genomförda studier visade att allvarliga beteendemässiga motoriska brister och förlust av motoriska neuroner i nervsystemet uppstod när ett Al-vaccin adjuvant applicerades på en djurmodell. Möss som injicerats med Al-hydroxid uppvisade en signifikant ökning av celldöd i ryggmärgen och den motoriska cortexen, vilket främst påverkade de motoriska neuronerna och framkallade neuroinflammation. Effekterna liknade i hög grad de skador som ses i mänsklig ALS .
Som nyligen rapporterats tycks även immunsystemet vara känsligt för Al-exponering . Effekter av Al på autoimmunitet, oral tolerans, CD4+ och CD8+ uttryck, överkänslighet och erytrocyt immunfunktion tyder på dess immunotoxikologiska aktivitet. Det har föreslagits att många av egenskaperna hos Al-inducerad neurotoxicitet delvis kan härröra från autoimmuna reaktioner.
För det sista, i en nyligen publicerad rapport av Exley C anses Al vara en potentiell bidragande orsak till uppkomsten, utvecklingen och aggressiviteten av ND, även om det verkar vara svårt att fastställa när det bidrar till sjukdomens etiologi. Eftersom Al utgör en risk för människors hälsa är det emellertid nödvändigt att genomföra åtgärder för att minska dess kroppsbelastning till den lägsta praktiska gränsen.
Vilken strategi för gemensam behandling av skador som framkallats av giftiga metaller kan föreslås? Intracellulärt upptag av giftiga metaller skulle förhindras på lämpligt sätt av relevanta hämmare (chelatorer), medan ROS-generering och ROS-medierade processer skulle förhindras eller förbättras av relevanta antioxidanter och fångar av fria radikaler och Fe.
I vår erfarenhet har avlägsnande av giftiga metaller, som visats i tidigare studier och i den här studien, lett till positiva effekter genom att patienternas symtom har förbättrats. Inga negativa effekter observerades av EDTA-behandlingar. Metallborttagningen verkade gradvis i tiden och föreslog många kelatbehandlingar. Sammanfattningsvis visar vi i denna studie att EDTA-kelateringsbehandling kunde minska Al-belastningen hos patienter som drabbats av ND genom att förbättra deras kliniska tillstånd. Vi hoppas att en sådan behandling i framtiden kommer att betraktas som ett användbart verktyg för att förbättra ND-patienters symtom.
Intressekonflikt
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.