4.3 Från linsblåsan till den mogna linsen
Linsblåsan bildas genom att stänga linsbägaren (även kallad linsgropen) och lossnar från den ytliga ektodermen. Ett mellansteg är utvecklingen av en linsstjälk som håller ihop den stängda vesikeln och ytektodermet under några timmar (hos musen). Linsblåsan är nästan sfärisk med ett stort centralt hålrum; cellerna från dess bakre pol förlängs tills de når de främre epitelcellerna och fyller hela linsblåsan; dessa förlängda celler kallas primära linsfiberceller. Detta steg inträffar runt dag 44 i dräktigheten hos mänskliga embryon och vid E11,5 hos mus (fig. 10.5). Cellerna vid linsblåsans främre pol förblir som epitelceller. Mitotiskt aktiva celler som omger den centrala regionen av linsepitelet rör sig till den ekvatoriala regionen (eller linsbågsregionen), där de förlängs och differentieras till sekundära linsfibrer. Mittlinjen, där sekundära linsfibrer från motsatta punkter i ekvatorn förenas, kallas den främre och bakre linsens sutur. De sekundära linsfibrerna bildar koncentriska lager runt de primära fibrerna i linsens kärna (hos musen vid dag E15,5; fig. 10.5). Med detta arrangemang är linsfibrerna mot periferin successivt yngre när det gäller utveckling och differentiering. Så länge linsen växer flyttar nya sekundära fibrer in från ekvatorn på linsens yttre cortex.
Figur 10.5. Bildandet av linsen. När linsblåsan har bildats sträcker sig de primära linsfibrerna ut från linsblåsans bakre epitel och fyller hela dess lumen. De sekundära fibercellerna börjar förlängas vid linsbågsområdet; fibrerna från motsatta sidor möts vid den främre och bakre polen och ger upphov till linsens suturer (som är Y-formade i den tredimensionella bilden). Det sista steget i linsdifferentieringen är nedbrytningen av cellkärnor och mitokondrier, vilket sker runt födseln hos musen (modifierat enligt Graw, 2003; med tillstånd från Nature Publishing Group).
Både de primära och sekundära fibercellerna förlorar sina mitokondrier och cellkärnor under den slutliga differentieringsprocessen: för de primära fibrerna äger den rum hos möss vid E17/E18 och avslutas 2 veckor efter födseln, när mössen öppnar sina ögonlock (Vrensen et al, 1991). De sekundära fibercellerna, som omger de primära fibercellerna, förlorar sina organeller, när de flyttar från den yttre till den inre cortexen (Kuwabara och Imaizumi, 1974).
De främre epitelcellerna förblir dock mitotiskt aktiva som en stamcellsnisch som producerar sekundära fiberceller. Dessa sekundära linsfiberceller är terminalt differentierade celler och förlorar även sina organeller när de pressas djupare in i linsen av de efterföljande fibercellerna.
I zebrafisken förekommer dock flera skillnader i linsens utveckling och differentiering. I synnerhet sker den primära fibercellsutvidgningen på ett cirkulärt sätt, vilket resulterar i en embryonal linsenkärna med koncentriska skal av fibrer. Det mycket täta avståndet mellan kärnorna i de differentierande sekundära fibrerna i en smal zon nära det ekvatoriella epitelet tyder dock på att differentieringen av sekundära fiberceller avviker från den som beskrivs för däggdjurs- eller fågellinser. På grund av dessa skillnader bör man vara försiktig när man extrapolerar resultat från zebrafiskar till utveckling eller funktion av linser hos mus eller människor (Dahm et al., 2007).
I möss karakteriserar minst två gener, Pitx3 och Foxe3, betydelsen av linsstjälkstadiets övergående karaktär. I musembryon uttrycks Pitx3 i linsen under utveckling med början vid E11, först i linsblåsan och senare i det främre epitelet och linsekvatorn. Mutationer i de regulatoriska eller kodande regionerna av Pitx3-genen har visat sig orsaka fenotypen aphakia (ak) eller ögonlösa (eyl) musmutanter, som saknar linser och pupiller (Rieger et al., 2001; Rosemann et al., 2010; Semina et al., 2000). Hos dessa möss kvarstår linsstjälken i flera dagar vilket slutligen leder till en nedbrytning av den rudimentära linsblåsan, och näthinnevävnad fyller hela ögongloben. Eftersom Pitx3 också uttrycks i dopaminerga neuroner i substantia nigra är dessa möss också utmärkta modeller för Parkinsons sjukdom (Rosemann et al., 2010). I motsats till musen orsakar mutationer i det mänskliga PITX3 anterior segment mesenchymal dysgenesis (ASMD; Semina et al., 1998).
Ak/ak-mössen har en okulär fenotyp som är mycket lik dyl-mössen (dysgena linser), vilket tyder på att de båda generna är involverade i samma biologiska process. Blixt et al. (2000) visade att dylfenotypen förmedlas av en mutation i Foxe3-genen. Hos musen uttrycks FoxE3 i ögat under utveckling runt E9,5, i början av induktionen av lins placode (Fig. 10.2). När lins placode bildas ökar uttrycket av FoxE3 och blir begränsat till linsblåsan när den lossnar från den ytliga ektodermen. Två mutationer inom FoxE3:s DNA-bindningsdomän identifierades i dylmöss. Hos människor är mutationer i FoxE3 ansvariga för anterior segment optical dysgenesis (ASOD). På grund av FOXE3:s uttrycksmönster och den varierande fenotypen hos de heterozygota dylmössen undersöktes en liten kohort av patienter med Peters-anomali hos vilka inga PAX6-mutationer kunde påvisas för FOXE3-mutationer. En av patienterna visade sig vara heterozygot för en Arg90Leu-substitution som påverkar den DNA-bindande domänen hos FOXE3 (Ormestad et al., 2002).
Det andra viktiga steget är förlängningen av cellerna på den bakre halvan av linsblåsan som fyller den med primära fiberceller. I musmutanten ”opaque flecks in the lens” påverkar en punktmutation den grundläggande regionen av Maf (kodad av en onkogen, ansvarig för muskuloaponeurotiskt fibrosarkom) och förhindrar korrekt bildning av de primära linsfibrerna vilket leder till en fenotyp som liknar den pulverulenta katarakt som förekommer i en mänsklig familj (Lyon et al., 2003). Mammalian MAF uttrycks i lins placode och linsblåsan, och senare i de primära linsfibrerna.
Samma sak har Puk et al. (2008) nyligen karakteriserat en ny etyl nitroso-urea (ENU)-inducerad musmutant med en fenotyp för små ögon och en tom linsblåsan i homozygot tillstånd. I detta fall identifierades en mutation i genen Gjf1 (även kallad Gje1). Hos musen kodar genen Gjf1 för ett connexinliknande protein på 23,8 kDa, som uttrycks i den bakre delen av linsblåsan, där den primära fiberförlängningen börjar. I mutanterna ändras uttrycksmönstret för Pax6, Prox1, Six3 och Crygd, men inte mönstret för Pax2. Genen Gjf1 anses vara nödvändig för bildandet av de primära linsfibrerna (Puk et al., 2008) och kan betraktas som ett nedströmsmål för transkriptionsfaktorn c-Maf; mutationer i motsvarande Maf-gen leder till en liknande fenotyp hos musen (Lyon et al., 2003; Perveen et al., 2007). För närvarande är det oklart om det finns en funktionell mänsklig motsvarighet till musens Gjf1-gen.
En tredje fenotyp utan förlängning av de primära linsfibrerna orsakas av knockout av Pparbp-genen (som kodar för peroxisome proliferator activator receptor binding protein; Crawford et al., 2002). Förhållandet mellan dessa tre funktionellt skilda proteiner för bildandet av de primära linsfibercellerna är ännu inte klarlagt.
Förutom dessa tre gener kan Wnt-signalering också spela en roll för förlängningen av de primära fibercellerna. Faber et al. rapporterade 2002 en dominant-negativ form av Bmp-receptorn 1b (gensymbol: Bmpr1b) i transgena möss. Dessa transgena musmutanter visar en hämning av den primära fibercellsutvecklingen, dock på ett asymmetriskt sätt: den uppträdde endast på den nasala sidan av linsen i den ventrala halvan. Författarna drog slutsatsen att olika differentieringsstimuli kan vara aktiva i olika kvadranter.
På den främre sidan förblir linsepitelcellerna de enda mitotiskt aktiva cellerna i linsen. De kännetecknas av ett pågående uttryck av flera Wnt-gener: de detaljerade uttrycksuppgifter som rapporterats skiljer sig dock inte bara mellan kycklingar och möss, utan varierar också mellan olika stammar av möss (för detaljer, se en översikt av de Iongh et al., 2006). Det står dock klart att generna för Wnt-signalvägen uttrycks främst i linsens epitelceller. Fzd-receptorer (gensymboler: Fzd1-8) och co-receptorer Lrp5 och Lrp6, Sfrp1-3 och Dkk1-3 gener har också visat sig uttryckas under linsutvecklingen. De finns huvudsakligen i epitelcellerna; det enda undantaget är Fzd6 som uttrycks alltmer i differentierande fiberceller (de Iongh et al., 2006). Som ett exempel har lrp6-nollmutanter analyserats som visar (förutom vissa andra defekter; se MGI-databasen) små ögon och avvikande linser som kännetecknas av ett ofullständigt bildat främre epitel som resulterar i extrusion av linsfibrer in i det överliggande hornhinnestromat (Stump et al., 2003).
Den viktigaste utlösande faktorn för differentiering av linsfibrerna är dock Fgf-signalering. Ett av de mest betydelsefulla resultaten visade i linsexplantat från råttor att olika koncentrationer av Fgf2 (tidigare känt som ”basic Fgf” eller ”bFGF”) är ansvariga för linscellsproliferation, migration och differentiering av linsfiberceller (McAvoy och Chamberlain, 1989). Eftersom det fortfarande är okänt vilka av de flera Fgf som är inblandade i linsinduktionen (Smith et al., 2010) hade forskningen fokuserat på Fgf-receptorerna. Som nämnts ovan uppstod allvarliga defekter i linsfibercellernas förlängning i linser som saknade tre Fgf-receptorgener (Fgfr1-3; Zhao et al., 2008). Fgf-signalering är också nödvändig för att starta den icke-kanoniska Wnt-vägen (dvs, oberoende av β-catenin) i linsepitelceller; i linsexplantat leder den till ackumulering av β-kristallin, en markör för fibercellsdifferentiering (Lyo och Joo, 2004).
Den mogna linsen innehåller flera klasser av strukturella proteiner: kristallinerna (α-, β-, γ-, δ-, μ-, ζ-kristalliner), transmembranproteiner (t.ex. MP19 och MIP26 och connexinerna 43, 46 och 50), vissa kollagener samt cytoskelett- och intermediära filamentproteiner. Mutationer i motsvarande gener (eller specifika transkriptionsfaktorer) leder till funktionella obalanser och linsotätheter (katarakt). Kataraktens debutålder och arvsformen beror på uttrycket av de motsvarande generna och på det område som påverkas av den underliggande mutationen. Totalt är ∼60 olika gener kända för att vara ansvariga för kataraktbildning hos möss och människor. En detaljerad diskussion om motsvarande mutationer och deras funktionella konsekvenser ligger utanför ramen för detta kapitel; översikter som motsvarar just detta ämne har nyligen publicerats av författaren (Graw, 2009a,b).