Antiglykemisk effekt av vattenextraherbart arabinoxylan från vetealjon och vetekli

Abstract

Studierna av arabinoxylans (AX) polysackariders effekter på glukosresponsen efter födseln har resulterat i kontrasterande resultat på grund av mångfalden i AX-strukturerna. Fyra vattenextraherbara AX-extrakt (WEAX) som erhållits från vete aleuron och kli användes för att undersöka (a) effekten av AX på aktiviteter av α-amylas och α-glukosidas, (b) inverkan av AX kemiska sammansättning på deras hämmande potens, och (c) kinetik för enzymhämning. α-amylasaktiviteten påverkades inte signifikant av närvaron av WEAX-fraktioner oavsett typ eller koncentration. WEAX hämmade α-glukosidasaktiviteten endast när maltos användes som substrat, men inte sackaros. IC50-värdena för WEAX (- mg/mL) var starkt korrelerade med ferulsyrainnehållet (), förhållandet mellan arabinos och xylos () och de relativa andelarna av xylos som är osubstituerad (), disubstituerad () och monosubstituerad (). Lineweaver-Burk-ritningen tyder på att enzymhämningen inte är kompetitiv. Våra resultat tyder således på att de antiglykemiska egenskaperna hos WEAX kan härröra från direkt hämning av α-glukosidasaktiviteten.

1. Introduktion

Prevalensen av typ 2-diabetes ökar globalt. Diabetes är en kronisk sjukdom som epitetas av högt cirkulerande plasmaglukos. Därför är hanteringen av postprandial glukos avgörande för förebyggande och behandling av patienter med typ 2-diabetes. Interventionsstudier på människor har visat att konsumtion av en arabinoxylan- (AX-) rik kost minskar de postprandiala blodglukosnivåerna hos friska, personer med nedsatt glukostolerans och diabetiker . Mohlig och medarbetare fann däremot ingen effekt på glukosresponsen när friska försökspersoner fick brödbröd kompletterat med AX. Djurstudier har också gett blandade resultat när det gäller effekten av AX-tillskott . De bakomliggande mekanismerna är fortfarande oklara, men det påstås att lösliga fibrer ökar viskositeten i lumen och därmed fördröjer absorptionen av näringsämnen . Den synliga viskositeten hos AX-lösningar påverkas av AX:s asymmetriska konformation och molekylvikt samt av polymerkoncentrationen . Av dessa tre faktorer verkar koncentrationen av AX påverka viskositeten mest. AX:s effekt på blodglukos är således dosberoende. AX-lösningarnas synliga viskositet är också beroende av skjuvspänningen, vilket innebär att högre skjuvspänning leder till skjuvförtunning, ett beteende som är karakteristiskt för icke newtonska vätskor . Nya studier tyder på att AX:s viskositetseffekt kan motverkas av stark tarmperistaltik.

Den molekylära strukturen hos AX är komplex och heterogen. AX består av xylans ryggrad bestående av () länkade β-D-xylopyranosylrester (Xylp) med α-L-arabinofuranosylrester (Araf) som är länkade till xylans ryggrad i C(O)-2 och C(O)-3 och/eller i både C(O)-2 och C(O)-3 positioner . Xylosrester kan också vara substituerade med glukuronsyra- och/eller metylglukuronsyrabindningar . Ferulasyre- eller kumarsyrarester är esterlänkade till arabinosrester i C(O)-5-positionen . Förhållandet mellan arabinos och xylos, mönstret av arabinosersättning, graden av feruloylering och molekylvikten varierar kraftigt mellan och inom spannmålskärnor . Arabinoxylaner (AX) utgör den största delen av kostfibrerna i spannmålskorn (60-70 %) och deras innehåll varierar med källan eller kornfraktionen. AX utgör 1,3-2,7 % w/w av vete . Vete aleuron och perikarp innehåller 20 respektive 45 % AX . En stor del av AX i vete är vattenolöslig (70-86 %).

Dietära smältbara kolhydrater hydrolyseras till de monomera sockerarterna glukos eller fruktos innan de tas upp i mag-tarmkanalen. Stärkelse smälts främst till maltos och andra kortkedjiga kolhydrater av saliv- och bukspottkörtelns amylas. De resulterande (maltos, maltotrios och α-limitdextriner) och sackaros spjälkas till glukos eller fruktos av de α-glukosidaser (maltas-glukoamylas och sackaros-isomaltas) som finns i borstkanten av tunntarmen . Sockerabsorptionen i tunntarmen sker huvudsakligen med hjälp av GLUT2-, GLUT5- och SGLT1-transportörerna . En minskning av postprandial hyperglykemi kan således uppnås genom att man begränsar tarmens kolhydratspjälkning eller upptag av kolhydrater. Trots de enorma skillnaderna i AX:s struktur rapporterar de flesta studier mycket lite eller inga detaljer om sammansättningen eller strukturen hos den AX som används, vilket gör det svårt att jämföra resultaten om AX:s effekt på blodglukos efter hand. Det finns också mycket begränsade uppgifter om effekten av renade vattenextraherbara AX-ämnen på enzymer för matsmältning av kolhydrater. I denna studie syftade vi därför till att undersöka (a) effekten av AX på α-amylas- och α-glukosidasaktivitet, (b) påverkan av AX kemiska sammansättning på deras hämningseffekt och (c) kinetiken för enzymhämning.

2. Material och metoder

2.1. Kemikalier och reagenser

En kommersiell vete aleuron (Grainwise wheat aleuron) var en gåva från Cargill Limited och Horizon Milling (Wichita, Kansas, USA). Den består av 4,5, 15,2, 7,4 respektive 2,5 % lipid, protein, aska och stärkelse. Klid av hårdrött vintervete köptes lokalt från Bulk Barn (Winnipeg, Manitoba, Kanada). Dess fukt-, ask- och proteinhalt analyserades till 5,8, 5,3 respektive 11,1 %. Omodifierad stärkelse från vete, maltos, sackaros, acarbose, α-amylas från svinpankreas (EC 3.2.1.1.1, typ VI-B), amyloglukosidas (EC 3.2.1.3) från aspergillus och tarmacetonpulver från råtta köptes från Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Ammoniumsulfat, alla syror och organiska lösningsmedel köptes från Fischer Scientific (Whitby, Ontario, Kanada). Testkit för maltos, sackaros och glukos (K-MASUG 08/13) köptes från Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Irland). Alla kemikalier som användes var av analytisk eller HPLC-kvalitet.

2.2. Vattenextraherbar arabinoxylanberedning

De endogena enzymerna inaktiverades genom att vete kli och vete aleuronprover (~200 g) kokades i 2 liter vattenhaltig etanol (80 %, v/v) vid 85 °C under återflöde i 2 timmar. Supernatanten kastades bort och resterna lufttorkades i en rökhuva över natten i rumstemperatur. Fraktioner som kan extraheras med vatten isolerades från det lufttorkade kliet eller aleuronet (150 g) vid 45 °C enligt den metod som beskrivs av Izydorczyk och Biliaderis . Vattenextraktet har destarkats med α-amylas (1821 U/L) och avproteiniserats med celit och fuller’s earth. Det renade materialet fraktionerades genom graderad ammoniumsulfat (AS)-utfällning och fraktioner erhölls vid 50 och 75 % AS-mättnad. Det insamlade materialet frystorkades efter att ha dialyserats (membran med 12 kDa cut-off membran) i 48 timmar. Vattenextraherbara fraktioner som samlats in från vete aleuron märktes (WA) följt av den koncentration av AS vid vilken de erhölls (WA-f50 och WA-f75). På samma sätt betecknades de insamlade materialen från vetekli (WB) som WB-f50 och WB-f75. De kemiska och strukturella beskrivningarna av WEAX-fraktionerna presenteras i tabell 1.

2.3. Inhibitionstest för α-amylasaktivitet

Vetestärkelse (300 mg) suspenderades i 15 mL natriumfosfatbuffert (pH 6,9, 0,1 M) innehållande 1 mM kalciumklorid och kokades vid 95°C i 15 minuter . WEAX-fraktioner (40 mg) löstes upp i 2 mL natriumfosfatbuffert. Proverna späddes så att slutkoncentrationen i reaktionsblandningen var 0,0, 0,2, 0,3 och 0,5 % (w/v). Lika stora volymer (200 μL) av stärkelse och WEAX (eller kontroll) blandades och virvlades. Stärkelsehydrolysen inleddes genom att 70 μL α-amylas (130 U/mL) från svinpankreas och 40 μL amyloglukosidas (240 U/mL) från svamp inleddes. Reaktionen stoppades efter 30 minuter genom uppvärmning vid 95 °C i 5 minuter. Blandningen kyldes omedelbart på is och centrifugerades (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Tyskland). Supernatanterna samlades upp och analyserades för glukos med hjälp av Megazyme glukostestkit. Studier av mänsklig intervention har rapporterat effektiviteten av en AX-koncentration på 0,25-0,70 % och därför har vi valt detta koncentrationsintervall.

2.4. Hämningsassay för α-glukosidasaktivitet i tarmen hos råttor

Den α-glukosidashämmande metoden av Oki et al. användes med modifieringar. Kortfattat blandades råttintestinalt acetonpulver (500 mg) med 10 mL natriumfosfatbuffert (pH 6,9, 0,1 M) och sonicerades i isbad i 30 sekunder (12 gånger) med 15 sekunders paus för att förhindra värmeuppbyggnad. Blandningen centrifugerades sedan vid 10000 vid 4 °C i 10 minuter. Supernatanten samlades upp och märktes med rat intestinal α-glukosidas. WEAX-prover (40 mg) löstes upp i 2 mL natriumfosfatbuffert (pH 6,9, 0,1 M). Senare blandades 50 μL α-glukosidas från råttans tarm med 100 μL prov eller buffert (kontroll) och inkuberades vid 37 °C i 5 minuter. Femtio μL 20 mM sackaros eller 4 mM maltos tillsattes och inkuberades ytterligare i 60 minuter (sackaros) eller 30 minuter (maltos). Den slutliga koncentrationen av WEAX-fraktionen var 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 och 0,0 % (w/v). Enzymaktiviteten stoppades genom upphettning vid 95 °C i 10 minuter. Efter centrifugering vid 10000 i 10 minuter samlades supernatanterna upp för glukosanalys med hjälp av Megazyme GOPOD glukostestkit. Hämning av alfa-glukosidas (sukras eller maltas) i procent beräknades som . IC50-värdet bestämdes från diagrammet med % α-glukosidashämning mot provkoncentrationen. Hämning av α-glukosidas i råttans tarm med acarbose (en känd α-glukosidashämmare) gjordes också som jämförelse. Acarbosekoncentrationer på 1,625, 3,25, 4,9, 6,5, 9,8 och 13 μg/mL användes i stället för provet.

2,5. Statistisk analys

Alla analyser utfördes i sexdubbla exemplar (om inget annat anges) och all statistik beräknades med hjälp av en envägs variansanalys (ANOVA) på en statistisk programvara JMP 12 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Provmedelvärden jämfördes med hjälp av Tukey HSD-metoden och signifikanta skillnader fastställdes vid . Korrelationer mellan parametrar beräknades med hjälp av Pearsons korrelationstest.

3. Resultat och diskussion

Effekterna av WEAX på stärkelsehydrolys presenteras i figur 1. Vi jämförde mängden glukos som frigjordes under 30 minuters inkubation med α-amylas i närvaro eller frånvaro av WEAX-fraktioner. Tillsats av WEAX-fraktioner minskade numeriskt mängden glukos som producerades jämfört med kontrollbehandlingen. Statistiska jämförelser av behandlingsgrupper och kontroll visade dock att den genomsnittliga skillnaden inte var signifikant () för WA-f50, WA-f75 och WB-f75 oavsett WEAX-koncentration. Närvaron av 0,5 % WB-f50 resulterade i en signifikant minskning av amylolysen jämfört med kontrollen (). Våra observationer av alfa-amylasaktivitet stod dock i kontrast till andra rapporter i litteraturen, möjligen på grund av koncentrationen och typen av AX. Amylolys av stärkelse utfördes i närvaro av 1 och 2 % AX och den AX som användes saknade ferulasyra . Vi använde koncentrationer av AX (~5-10 g) som motsvarar de koncentrationer som rapporterats minska det postprandiala blodsockret i studier på människor .

Figur 1

Effekt av vattenextraherbart arabinoxylan på stärkelsehydrolys.

Tabell 2 visar effekten av WEAX på α-glukosidasaktiviteten i närvaro av sackaros eller maltos som substrat. Uppgifterna presenteras som IC50 som är den koncentration av inhibitorn som resulterar i 50 % hämning av α-glukosidasaktiviteten. IC50-värdena varierade från 4,88-10,14 mg/ml mot α-glukosidasaktivitet med maltos som substrat. Ingen hämning observerades dock när sackaros användes som substrat. Den hämmande effekten av WEAX mot intestinal maltas var 1000-2000 gånger mindre jämfört med acarbose (en positiv kontroll). Det är en vanlig hypotes att viskositet kan vara orsaken till AX:s effekt på postprandial glukos. Vogel et al. har därför utfodrat råttor med en modifierad AX-produkt från vetekli för att studera effekten av viskositet. Hämningen av tarmens alfa-glukosidas av AX-mono-/oligosackarider var också relaterad till deras ferulasyrorelation. WA-f50 och WB-f75 hade alltså betydligt olika hämmande effekt på α-glukosidasaktiviteten trots att de hade liknande relativa proportioner av osubstituerade (un-Xylp), monosubstituerade (2-Xylp eller 3-Xylp) och disubstituerade xylosrester (2,3-Xylp) och substitutionsgrad, men olika ferulasyreinnehåll.

α-Glukosidasaktivitet (IC50) Arabinos- till xylosekvot Ferulinsyrahalt Unsub-Xylp Mono-Xylp vid C (O)-32 Mono-Xylp vid C (O)-32 Mono-Xylp vid C (O)-323 Total Mono-Xylp Di-Xylp Molekylvikt 0.23 Uronisk syra 0,36

Data representerar värden för Pearsons korrelationskoefficient vid . un-Xylp: icke-substituerade xyloserester, mono-Xylp: monosubstituerade xyloserester, di-Xylp: C (O)-2 och C (O)-3 disubstituerade xyloserester.

Tabell 3

Korrelationskoefficienten för arabinoxylaners hämning av α-glukosidasaktivitet och dess strukturella egenskaper.

Arabinos till xylosekvot är ett mått på substitutionsgrad (DS). Ett starkt negativt linjärt samband ( = -0,67) observerades mellan DS och IC50. Detta kan ha varit en följd av ökad löslighet hos AX på grund av hög DS. Högsubstituerad WEAX verkar alltså ha ett lägre IC50-värde (hög hämningspotential). Samma observation stöddes av det negativa sambandet mellan hämmande effekt och den relativa andelen osubstituerade xylosrester. Det uppenbara förhållandet mellan di-Xyl- och mono-Xylrester tycktes inte ha någon inverkan, men omfattningen av xylos-substitutionen visade sig ha en effekt. Det är därför troligt att effekten på α-glukosidasaktiviteten kan härröra från arabinosrester i WEAX. Det finns rapporter om arabinos som hämmar α-glukosidasaktiviteten . Försök att avlägsna arabinoserester från WEAX med hjälp av arabinofuranosidas var inte framgångsrika för att bevisa hypotesen. Vi noterade dock att mono-Xyl vid C(O)-2 var en viktig faktor jämfört med mono-Xyl vid C(O)-3, vilket tyder på att den hämmande styrkan var mer än bara närvaron av arabinosrester. Det fanns en stark korrelation mellan mono-Xyl vid C(O)-2 och ferulasyrainnehållet ( = 0,99). Det är således möjligt att det observerade inflytandet av DS kan ha härletts från det av ferulsyra.

Lineweaver-Burk-plotten (figur 2) användes för att beräkna den skenbara maximala hastigheten () och Michaelis-Menten-konstanten () för α-glukosidasaktivitet på maltos i närvaro och frånvaro av WEAX. Effekten av WEAX-fraktionen på och analyserades för att bestämma typen av hämning. och α-glukosidasets α-glukosidasaktivitet för maltos i frånvaro av WEAX-fraktioner var 17,5 μg glukos per minut respektive 5,99 mM. Tabell 4 visar att tillsats av WEAX-fraktioner minskade både och värdena, vilket tyder på att WEAX hämmade α-glukosidasaktiviteten på ett icke-kompetitivt sätt. Ett typiskt kännetecken för okompetitiv hämning är att både och minskar i närvaro av hämmare. Det är därför troligt att WEAX-fraktionerna binder till enzymsubstratkomplexet och därmed minskar både och . Arabinos visade sig också hämma α-glukosidasaktiviteten på ett icke-kompetitivt sätt .

Figur 2

Lineweaver-Burk-plot för hämning av α-glukosidas i råttans tarm med vattenextraherbar arabinoxylan ().

Våra resultat kan ge en förklaring till den inkonsekvens som observerats i litteraturen när det gäller effekten av AX på den postprandiella glukosnivån. Utfodring av Zuker diabetiska råttor med AX (Ara/Xyl = 0,9) kompletterat bröd resulterade i en signifikant minskning av postprandial blodglukosnivå . Däremot hade intag av AX (Ara/Xyl = 0,5) ingen effekt på blodglukosresponsen. Även kosttillskott med 6 och 12 g AX (Ara/Xyl = 0,66 eller 0,8) minskade blodsockret hos både friska och diabetiker . AX (Ara/Xyl = 0,8) dämpade dock inte den postprandiala glukosresponsen hos friska vuxna människor . Grisar som utfodrats med vitt bröd som kompletterats med AX hade ett minskat nettoglukosflöde jämfört med grisar som utfodrats med vitt bröd . Avsaknaden av detaljerade uppgifter om kemisk sammansättning och struktur gör det svårt att jämföra resultaten om AX:s effektivitet. Även om koncentrationerna av de använda AX:erna kan vara desamma skulle deras effektivitet alltså bero på vilken typ av AX:er som används. Vi har visat att AX som erhållits vid 50 % ammoniumsulfatmättnad uppvisade högre hämmande potens jämfört med AX som erhållits vid 75 %.

4. Slutsats

Resultaten av den här studien indikerade att arabinoxylanernas antiglykemiska effekt kan härledas till att de hämmar tarmens α-glukosidasaktivitet men inte amylasaktivitet. Styrkan hos vattenextraherbar AX på α-glukosidasaktivitet påverkades av ferulsyrainnehållet arabinos till xylosförhållandet och mönstret av xylosersättning. Resultaten tyder också på att hämning av α-glukosidasaktiviteten sker genom en icke-kompetitiv mekanism. Således kan konsumtion av kost som är rik på vattenextraherbar AX dämpa den postprandiella blodglukosnivån.

Offentliggörande

En del av resultaten presenterades som en muntlig poster vid symposiet Functional Foods and Natural Health Products Graduate Research (FFNHP) symposium/Therapeutic Applications of Functional Foods and Bioactives (TAFFB) konferens som hölls på St-Boniface Hospital Albrechtsen Research Centre från den 20 till den 22 april 2016.

Intressekonflikter

Alla erhållna medel eller materiellt stöd ledde inte till intressekonflikter vid publicering av detta manuskript.

Acknowledgments

Denna forskning finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) genom Discovery Grant Programme. Författarna är också tacksamma mot Cargill Limited för tillhandahållande av vete aleuronprover och Ce Zhou, Alison Ser och Pat Kenyon från Department of Food Science, University of Manitoba, för deras tekniska stöd.