II Mikrobiologiska kvalitetsspecifikationer
Gnotobiotiska djur, oavsett om de är axenic (dvs, De utgör en liten del av de djur som används inom forskningen, men användningen av dem kommer sannolikt att öka i takt med att forskningen om mikrobiomets djupgående påverkan och olika effekter på människors hälsa och forskningsmodellernas experimentella reaktioner ökar (Bech-Nielsen et al., 2012; Friswell et al., 2010; Grada och Weinbrecht, 2013). Som redan nämnts kallas de flesta försöksdjur för SPF för att ange att de av HM har visats vara fria från patogener på en uteslutningslista.
Uteslutningslistorna för gnagare, kaniner och andra vanliga försöksdjursarter har i hög grad harmoniserats i hela den utvecklade världen på grund av de ansträngningar som gjorts av organisationer som arbetar med försöksdjursforskning (Guillen, 2012; Nicklas, 2008; Nicklas et al., 2002), och globaliseringen av den biomedicinska forskningen. Dessutom uppmuntrar konkurrensen om kunderna leverantörer att erbjuda SPF-djur som är fria från nyupptäckta patogener och diagnostiska laboratorier att utveckla tester för dessa patogener (Shek, 2000). Listorna över undantag för SPF-möss och -råttor är mer omfattande än de för kaniner och andra vanliga försöksdjursarter av ett antal skäl. För det första, eftersom möss och råttor utgör den stora majoriteten av de djur som används i forskning, är det rimligt att man vet mer om deras inhemska patogener än om andra mindre använda försöksdjursarter. Mångfalden av inavlade, naturligt och genetiskt konstruerade immunbristande muterade gnagarstammar som är mycket mottagliga för infektionssjukdomar (Compton et al, 2003; Franklin, 2006), i kombination med känsliga immunoassaymetoder (Smith, 1986b) och framsteg inom molekylärgenetik (Compton och Riley, 2001), har bidragit till upptäckten och karakteriseringen av patogener från gnagare (Fox et al., 1994; Ward et al., 1994a) som visat sig vara orsaken till allestädes närvarande, inaktiva infektioner i kolonier av laboratoriegnagare (Hsu et al., 2006; Shames et al., 1995). Dessutom har den dominerande användningen av forskningsmodeller för murin gnagare gett starka incitament för diagnostiska laboratorier och leverantörer att utveckla och erbjuda specifika serologiska och PCR-analyser för virala och andra krävande mikrobiella patogener – som inte kan påvisas genom direkt mikroskopisk undersökning eller kulturell isolering – snart efter det att de har upptäckts. Däremot har kommersiella leverantörer och diagnostiska laboratorier inte haft någon större efterfrågan från forskning och laboratoriedjurmedicin för att tillhandahålla rutinmässiga serologiska och PCR-tester för kaninvirus som erkändes för flera decennier sedan, t.ex. lapine parvovirus (Matsunaga och Matsuno, 1983) (vars sekvensering nyligen har visat att det rör sig om ett bocavirus (personlig kommunikation, K. Henderson)), rabbit enteric coronavirus (Deeb et al, 1993; Descoteaux och Lussier, 1990; Descoteaux et al., 1985) och leporid herpesvirus 2 (Matsunaga och Yamazaki, 1976). Slutligen är rederivation genom hysterektomi eller embryoöverföring (ET) för att eliminera alla exogena patogener standardpraxis för SPF-möss och -råttor, men inte för andra arter.
SPF-exkluderingslistor för möss och råttor har inkluderat alla kända exogena virus, oavsett virulens, eftersom virus, som obligatoriska intracellulära parasiter, i sig är invasiva; dessutom har det visats att även icke cytopatiska virusinfektioner ändrar ämnesomsättningen hos värdceller (Oldstone et al, 1982). Strikt iakttagande av dogmen att utesluta alla exogena virus från SPF-möss och -råttor har dock blivit opraktiskt vid många forskningsinstitutioner där asymtomatiska MNV-infektioner, främst hos genetiskt modifierade möss, anses vara alltför utbredda för att kunna elimineras. Ledande molekylärgenetisk teknik har nyligen avslöjat ett murint astrovirus (Farkas et al., 2012), som möjligen är vanligare hos möss än MNV, och kommer säkerligen att hitta ytterligare utbredda virus som hittills har undgått upptäckt eftersom de, liksom MPV, MNV och murint astrovirus, i hög grad är värddjursanpassade och i stort sett apatogena även för immunbristande värdar. Som nämnts är listorna över uteslutna virus för kaniner och andra försöksdjursarter mindre omfattande än för murina gnagare.
Ectoparasiter, helminter, patogena protozoer, bakterier och svampar ingår i listorna över uteslutna virus för alla SPF-djursarter. De patogena bakterier och svampar som utesluts för SPF-djur skiljer sig huvudsakligen från kommensala och inhemska organismer genom sin förmåga att korsa anatomiska och biokemiska barriärer för att etablera sig i nischer som saknar andra mikroorganismer, t.ex. de nedre luftvägarna och urogenitala trakterna, inre organ och intracellulärt (Casadevall och Pirofski, 2000; Council, 2009; Merrell och Falkow, 2004). Patogenitet är inte nödvändigtvis en oföränderlig egenskap hos den mikrobiella arten, eftersom normalt sett kommensala mikrober som Escherichia coli har omvandlats till patogener genom förvärv av virulensgener som överförts från andra bakterier i mobila genetiska element som plasmider, fager och transposoner (Dobrindt et al., 2004).
Mikrober klassificeras som primära patogener om de kan orsaka sjukdom hos immunkompetenta värdar. Exempel är Salmonella, Mycoplasma pulmonis, Helicobacter hepaticus och Clostridium piliforme (etiologin för Tyzzers sjukdom). Opportunistiska patogener som Pseudomonas aeruginosa, β-hemolytiska streptokocker, Staphylococcus aureus och Pneumocystis-svampar orsakar sjukdom främst hos immunsvaga värdar, oavsett om de (1) är immunsupprimerade genom bestrålning eller kemoterapi (Bosma et al., 1983; Cryz et al., 1983; Flynn, 1963; Homberger et al, 1993; Rosen och Berk, 1977; Waggie et al., 1988; Walzer et al., 1989; Weir et al., 1986; Weisbroth et al., 1999) eller (2) av naturliga skäl immunbristfälliga, t.ex. athymiska nakenmöss och SCID-möss (severe combined immunodeficient, dvs. svårt kombinerade immunbristfälliga) (Bosma et al., 1983; Clifford et al., 1995; Dole et al., 2013b; Henderson et al., 2012; Pantelouris, 1968; Ward et al., 1996). För det mesta ingår endast primära mikrobiella patogener i SPF:s uteslutningslistor för immunkompetenta djur. Opportunister läggs till, främst av kommersiella leverantörer, på listor för immunbristande och genetiskt modifierade mutantlinjer. Eftersom det inte är ovanligt att opportunister som S. aureus orsakar sjukdom i immunokompetenta standardstammar av gnagare (Besch-Williford och Franklin, 2007), som ofta används vid rederivation och avel av genetiskt modifierade linjer, har efterfrågan på immunokompetenta standardstammar av gnagare och bestånd som är fria från såväl opportunistiska som primära patogener ökat. Denna undergrupp av SPF-djur har kallats SOPF för specific opportunistic pathogen-free.
För att sammanfatta bestäms de infektiösa agens som finns på SPF-uteslutningslistorna av allmänna och institutionsspecifika kriterier. I allmänhet är SPF-exkluderingslistorna för möss och råttor mer omfattande än de för mindre populära djurarter eftersom fler av de inhemska viruspatogenerna från möss och mikrobiella patogener som är anpassade till värden har identifierats och studerats; serologiska och PCR-analyser görs tillgängliga för patogener från möss snart efter det att de har upptäckts; och rederivation för att eliminera alla exogena patogener från SPF-populationer av möss och råttor är standardpraxis. SPF-exkluderingslistorna för alla arter innehåller vanligtvis ektoparasiter, endoparasiter och mikrober som klassificeras som primära patogener samt virus; leverantörer lägger ofta till opportunistiska patogener för immunbristande och genetiskt manipulerade muterade murinmodeller.
Att följa konsensusnormerna för SPF kan vara problematiskt på en institution om prevalensen av infektioner är hög eller om barriärsystemen och metoderna inte är tillräckliga för att förhindra att oavsiktliga infektioner uppträder och sprids. Många forskningsintensiva akademiska institutioner har beslutat att fördelarna med att eliminera utbredda infektioner med nyligen erkända agens som MNV och Helicobacter, som sällan ger upphov till sjukdom och/eller har varit endemiska i deras forskningskolonier under många år, uppvägs av de störningar i forskningen och de kostnader som detta medför. Eliminering (och uteslutning) av utbredda patogener och efterlevnad av konsensusnormer för SPF minskar dock risken för att en patogen ska infektera ytterligare kolonier och störa forskningen, och förenklar utbytet av djurmodeller och samarbetsstudier med andra forskare och institutioner.