Historisk översikt
Fynd av traumatiskt inducerade axonavvikelser i de flesta experimentella modeller av trubbig skallskada, utan att myelinet bryts eller skador på intilliggande neurala eller gliala processer, har inte visat att axonerna slits eller skärs sönder direkt efter en traumatisk skada.910 Detta stöddes av frysbrottsstudier som utfördes i de tidiga faserna av axonskada och som inte visade vare sig omedelbar upplösning av det internodala myelinet eller tidig förlust av glial-axonalförbindelserna, vilket tyder på att myelinskidan i sig inte skadas omedelbart av skadekrafterna.23 I det här skedet postulerade båda de ovannämnda grupperna att krafterna från den traumatiska skadan först verkar på axolema eller axoplasma, samtidigt som myelinskidan skonas. Enligt denna hypotes skulle de mekaniska skadekrafterna kunna sträcka ut eller skada axolemman till dess biomekaniska gränser, varvid den joniska homeostasen skulle misslyckas och initiera reaktiva axonala förändringar.
I en serie efterföljande undersökningar av hjärnvävnad från både människor1222 och djur2124 , tillhandahöll Povlishock och kollegor emellertid data som stödde en initierande roll för det intraaxonala cytoskelettet. Deras studier avslöjade en komplex sekvens av intraaxonala händelser som ledde till reaktiva axonala förändringar. Med hjälp av antikroppar riktade mot neurofilamentkomponenten i cytoskelettet fann de att det skedde en fokal ackumulering av 68 kDa-underenheten (NF-L) inom en timme efter skadan och att denna ökning var dramatisk efter två timmar. Med tiden blev neurofilamenten oorganiserade och feljusterade i förhållande till axonets längdaxel. Ingen förlust eller upplösning av neurofilamenter upptäcktes. Dessa data stämmer därför inte överens med neutral proteasmedierad nedbrytning av cytoskelettet. I stället stödde ökningen av neurofilamentunderenheten 68kDa möjligheten av en traumatiskt inducerad omorganisering av neurofilamentpoolen. Vidare upptäcktes inga ultrastrukturella bevis på direkta axolemmala störningar i denna serie experiment. Man fann en utvikning och utvidgning av axolemman som tillskrivs den pågående reaktiva axonala förändringen. Dessa resultat tyder på att en direkt mekanisk effekt på axoncylinderns cytoskelett var den avgörande händelsen i den inledande patogenesen för axonskador.
Andra tillvägagångssätt tyder på att axolemma var inblandat i inledningen av reaktiv axonal förändring. Maxwell et al använde en modell med nervdragning för att analysera de morfologiska förändringarna i skadade axoner.18 Dessa författare gav belägg för att de första skadeplatserna, efter en icke-förstörande sträckskada, är Ranvier-knutarna, av vilka vissa utvecklar ”nodal blebs”. Dessa blödningar är axolemma-begränsade utsprång av axoplasma i det perinodala utrymmet och är mest talrika inom 15 minuter efter skadan, men mindre talrika vid senare intervaller. I skadade axoner med nodal blebs var neurofilamenten desorganiserade, avvek från axonets längdaxel och sträckte sig in i blebs. Däremot bibehöll mikrotubulerna sitt längsgående arrangemang och avvek inte in i blåsan. Kvantitativ analys av detta material visade att det fanns en betydande förlust av mikrotubuli och ett ökat avstånd mellan neurofilamenten i axoplasman i noder med tillhörande nodalblåsor. Denna förlust av mikrotubuli skulle kunna störa den snabba axoplasmatiska transporten och resultera i en fokal ansamling av membranösa organeller i angränsande paranodala områden av axonet för att bilda axonala svullnader. Dessutom gav dessa arbetare det första cytokemiska beviset för att stödja idén om kalciuminflöde i myelinerade nervfibrer som skadats av sträckning.25 Användning av oxalat-pyroantimonat-tekniken för lokalisering av kalcium visade ett ökat innehåll av pyroantimonatutfällning i nodalblåsor 15 minuter efter sträckningsskadan. Detta korrelerade med en minskning av märkningen av membranpumpens Ca2+ATPase-aktivitet i den nodala axolemman.26 Ranvierknutan är ett specialiserat område i axolemman där grupper av Na+-kanaler, ATPase-drivna pumpar för kalcium och en Na+/Ca2+-växlare är lokaliserade.2027 Förlust av membranpumpaktivitet i den nodala axolemman skulle därför kunna utgöra en mekanism för inflöde av fritt kalcium i Ranvierknutan efter en traumatisk skada. Detta stödjer hypotesen att krafterna från traumatisk skada resulterar i en fokal pertubation av axolemma med ett resulterande inflöde av fritt kalcium som kan aktivera en subpopulation av neutrala proteaser.25
Biofysikaliska undersökningar har använt nya tekniker för att analysera axolemma i experimentella förhållanden som är analoga med axonal skada. Efter en lindrig sträckskada uppstår en serie sammandragningar och expansioner i ischiasnervfibrer från en vuxen råtta. Denna formförändring är känd som ”beading”.28-30 Omvandlingen av den normala nervfiberns i huvudsak cylindriska form till en som är ”beaded” sker snabbt, inom 10 till 20 sekunder efter det att sträckningen påbörjats. De första experimentella uppgifterna tydde på att det är en mekanism som är kopplad till axolemma, cytoskelettet eller båda. I denna modell binder transmembranproteinet β1-integrin till både den extracellulära matrisen och cytoskelettet.14 Spänningar i den extracellulära matrisen signaleras via β1-integrin till cytoskelettet, vilket leder till att dess integritet och rumsliga arrangemang förändras. En nyligen genomförd studie har dock visat att beading inte kräver ett sammankopplat cytoskelett och har dragit slutsatsen att axolemma är den initierande platsen eller platsen för beadingförträngning.31 Det är värt att spekulera i att beading kan vara en del av den biologiska process som beskrivs som reaktiv axonal förändring i litteraturen i samband med traumatiskt inducerad axonskada.
Under de senaste fyra åren har axolemmas inblandning i patogenesen för axonskada blivit etablerad. Maxwell et al visade att allvarlig traumatisk hjärnskada orsakad av sidoacceleration kunde riva axolema direkt hos icke-mänskliga primater.32 Denna studie var den första som gav ultrastrukturella bevis som stödde begreppet axonal skjuvning vid traumatisk skada på hjärnan. Förlusten av axolemmal integritet var förknippad med en snabb upplösning av det axonala cytoskelettet. I de axoner som uppvisade axolemmal rivning eller fragmentering ersattes cytoskelettets filamentösa organisation av en flockig utfällning som var förenlig med en snabb upplösning av de underliggande cytoskelettproteinerna. Dessa förändringar upptäcktes inom några minuter efter skadan men förekom endast i en subpopulation av finkalibriga, tunt myeliniserade axoner efter allvarlig skada. Dessa morfologiska förändringar representerade en akut reaktion hos axonerna på skadan och kallades ”primär axotomi” – definierad som inträffande inom några minuter efter skadan, i motsats till fördröjd sekundär axotomi, som utvecklas under en period av timmar. I samma försöksmaterial fanns det inga tecken på att axolemaet hade brutits en timme efter skadan. Detta tyder på att det rubbade axonala membranet återförseglas inom en timme efter skadan.
Efter denna publikation omprövade Povlishock och kollegor sin centrala hypotes, som inte inkluderade en roll för axolema i initieringen av traumatiskt inducerad axonal skada. Vid närmare eftertanke föreslog de att direkt rivning av axolemma kan utgöra den allvarligaste delen av en rad axolemala störningar.33 Detta var en viktig vändpunkt, eftersom denna forskargrupp under många år hade hävdat att det inte fanns några bevis för direkta förändringar i axolemma efter skada i något av de många paradigm som de hade undersökt. Dessutom hade de hävdat att patobiologin vid traumatiskt inducerad axonskada berodde på en direkt försämring av axoplasmatransporten på grund av att skadans krafter direkt störde det axonala cytoskelettet71221 .
I en serie experiment som syftade till att undersöka denna fråga använde Povlishock och kollegor det extracellulära spårämnet pepparrotsperoxidas (HRP) för att avgöra om direkta förändringar i axolemman kunde påvisas vid traumatiska hjärnskador av lindrig och måttlig svårighetsgrad.3334 Detta nya tillvägagångssätt byggde på principen att makromolekylära spårämnen, såsom HRP, normalt sett utesluts från axoplasman av en intakt axolemma. Därför skulle detektion av intraaxonal peroxidasaktivitet utgöra ett bevis på axolemmal störning. Vidare skulle platsen för peroxidasaktivitet avgränsa den ursprungliga platsen för axonal pertubation, vilket ger en inblick i de initierande faktorer som är involverade i patogenesen för sekundär axotomi. Deras resultat visade att patobiologin vid traumatiskt inducerad axonskada var en heterogen och komplex process som involverade flera och varierande initierande patologier.
I synnerhet svårighetsgraden av den traumatiska skadan bestämde efterföljande händelser i axolemman och cytoskelettet, vilket resulterade i ett differentiellt svar på kränkningen. Särskilt efter måttlig skada upptäcktes direkta pertubationer av axolemma som återspeglades i dess förändrade permeabilitet för makromolekyler.33-35 Detta var förknippat med en snabb lokal kompaktering av axonala neurofilamenter, vilket framgick av en minskning av avståndet mellan interfilamenten. Efter mild traumatisk hjärnskada upptäcktes dock inga tecken på förändringar i axolema och en annan uppsättning cytoskeletalavvikelser, med felställning och axonal svullnad, hittades. Ett differentiellt svar på skada hade tidigare beskrivits i en modell för kompressionsbelastning av axonskador.36 Vid låg dragbelastning uppvisade axonerna axoplasmatisk nedbrytning oberoende av någon förändring av axolemmal integritet, vilket stämmer helt överens med de förändringar som beskrevs vid lindrig traumatisk hjärnskada. Vid allvarligare skador uppvisade samma axoner axolemmala förändringar som korrelerade med dramatisk axoplasmatisk svikt. Senare studier har utökat dessa resultat genom att visa att dessa förändringar i axolemma och cytoskelett varken är modell3435 eller artspecifika.37 Efter påvisandet av traumatiskt inducerade förändringar i axolemmal permeabilitet föreslog studierna dessutom att kalcium kan vara inblandat i initieringen av cytoskeletala händelser. Denna uppenbara motsättning till tidigare åsikter berodde på att de antog att kalcium verkade genom tidigare oidentifierade mekanismer. I stället för att aktivera proteolytiska enzymer kan kalcium verka mindre dramatiskt genom att förändra neurofilamentens sidoarmar, vilket gör att neurofilamenten kollapsar vilket resulterar i deras ökade packningstäthet. Det är tänkbart att dessa neurofilamentsidoarmar antingen kan klyvas av kalciummedierade processer eller dephophoryleras genom kinaser och fosfataser, vilket leder till att neurofilamentens tredimensionella avstånd ändras.1
Sammanfattningsvis har kontroversen kring axolemmas roll i patobiologin vid traumatiskt inducerad axonskada i viss utsträckning lösts. Det råder nu enighet om att en rubbning av axolemma är den inledande händelsen vid vissa former av traumatisk skada. Den mekanistiska grunden för sekundär axotomi anses dock nu vara alltmer komplex med förändringar i det axonala cytoskelettet som påvisas i de allvarligare formerna av traumatisk hjärnskada.