Bioaktivitetstestning – antistreptokockaktivitet
Den antibakteriella egenskapen hos de tre olika gröna teerna och deras extrakt och partiklar som erhållits vid 5 000 rpm, 10 000 rpm och 20000 rpm undersöktes för att undersöka deras antibakteriella egenskaper mot tandpatogenen S. mutans. För att optimera koncentrationen av det gröna teextraktet för ytterligare experiment testades sex olika koncentrationer (0 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL och 500 μL) av GT-0 (utan att avlägsna partiklar) och 5K-S från GT 1, GT 2 och GT 3 mot S. mutans. Figur 2 visar resultaten av denna undersökning. Som framgår av figur 2(a) visade den spektrofotometriska metoden att när det gäller GT-0 och 5K-S med avseende på alla tre gröna teer, ökade den antistreptokockrelaterade aktiviteten med ökande koncentration. Koncentrationer på 300 μL uppvisade optimal antimikrobiell aktivitet och valdes därför som den optimala koncentrationen för alla andra experiment i den här studien. Från och med nu utfördes alla experiment med 300 μL koncentrationer av grönt te-variablerna. I figur 2 b visas de resultat som erhållits genom den antimikrobiella bedömningen med hjälp av metoden för totalt antal livsdugliga organismer. Platträkningsresultaten korrelerade med de resultat som observerades vid spektrofotometerbaserade turbiditetsmätningar. En annan intressant observation från dessa resultat är den marginella förbättring av den antimikrobiella aktiviteten som observerades vid avlägsnande av partiklarna vid 5 000 varv per minut (5K-S) jämfört med GT-0. Jämfört med GT 1-0 visade GT 1-5K-S en ökad antibakteriell aktivitet, vilket även gäller för GT 2 och GT 3. Dessutom observerades GT 3 uppvisa den högsta antibakteriella aktiviteten och GT 1 den lägsta antibakteriella aktiviteten.
Optimering av koncentrationseffekten av testvariablerna för antimikrobiell aktivitet med hjälp av (a) spektrofotometrisk optisk densitet och (b) metoderna för totalt antal livsdugliga.
Då avlägsnandet av partiklarna från det gröna teet visade förändringar i det gröna teextraktets bioaktivitet, föreslogs det att göra en detaljerad undersökning för att studera denna effekt. En systematisk centrifugeringsprocess i tre steg, vid 5 000 rpm, 10 000 rpm och 20 000 rpm som syftade till att separera de största, mindre och ännu mindre partiklarna från extraktet genomfördes. Extraktet med de stora partiklarna (5K-S), de små partiklarna (10K-S) och de fina partiklarna (20K-S) samt partiklarna (5K-P, 10K-P och 20K-P) undersöktes med avseende på deras interaktion med S. mutans och deras individuella antibakteriella aktivitet. I figur 3 visas resultaten av denna studie. Som framgår av figur 3 (a-1, a-2) bekräftade både den turbiditetsbaserade metoden och platträkningsmetoden att när det gäller GT 1 resulterade avlägsnandet av 5K-P i en ökad (marginell ökning) antibakteriell aktivitet hos extraktet (5K-S) jämfört med GT 1-0. Avlägsnandet av 10K-P resulterade inte i någon ytterligare förbättring och 10K-S visade sig vanligtvis vara likvärdig med 5K-S-aktiviteten. Borttagningen av 20K-P resulterade dock i en tydlig förlust av antimikrobiell aktivitet i 20K-S. Denna observation var tydlig för GT 2 (fig. 3(b-1,b-2)) och GT 3 (fig. 3(c-1,c-2)). Även om trenden hade varierande grader av variation från GT 1 till GT 2 och GT 3 är det ett faktum att avlägsnandet av de stora partiklarna av grönt te från extraktet marginellt ökade den antibakteriella egenskapen hos extraktet av grönt te och att avlägsnandet av de mindre partikelfraktionerna av grönt te från extraktet ledde till en tydlig minskning av den antibakteriella aktiviteten hos grönt te förblir obestridligt.
Grafik som jämför den antibakteriella aktiviteten hos de olika testkomponenterna i (a) GT 1, (b) GT 2 och (c) GT 3 med hjälp av (a,b,c -1) spektrofotometrisk metod och (a,b,c -2) totalantalet viabler.
Det är dock viktigt att understryka här att varken 5K-P, 10K-P eller 20K-P partiklarna uppvisade en förbättrad fristående antibakteriell aktivitet högre än extrakten. 5K-P-partiklarna visade noll antibakteriell aktivitet, 10K-P visade en begränsad omfattning av antibakteriell aktivitet, medan 20K-Ps visade en viss aktivitet bland de andra två motsvarigheterna.
Realtidstestning av tandbakterier
För att utvärdera denna variation i bioaktiviteten hos grönt te-extrakterna rid av grönt te-partiklarna i realtidssystem, ställdes extrakterna upp mot riktiga prover av tandbionafilm från fem olika mänskliga volontärer. GT 0, 5K-S och 20K-S av GT 1, GT 2 och GT 3 testades. Figur 4 visar det totala antalet livsdugliga bakterier enligt platträkningsmetoden, vilket visar vilka bakterier som överlevde interaktionen med grönt te. Det var intressant att observera att trots provets komplexitet, jämfört med GT 0, visade 5K-S ökad antibakteriell aktivitet, medan 20K-S visade minskad antibakteriell aktivitet med avseende på alla tre gröna teer.
Resultat som visar den framgångsrika dentala antibakteriella effekten som demonstrerats på de verkliga proverna som erhållits från fem frivilliga människor.
Fluorescensavbildning av cellerna med hjälp av acridinorange, underlättar visualisering och differentiering mellan levande/döda celler efter behandling. Vi avbildade de dentala biofilmproverna från de fem frivilliga före och efter interaktion med GT 0, 5K-S och 20K-S samt kontroll. Figur 5 visar fluorescensresultaten som visar effekten av grönt te-variablerna på volontär 1 (A), volontär 2 (B), volontär 3 (C), volontär 4 (D) och volontär 5 (E). Som framgår av figur 5 a visar kontrollbilderna i A, B, C, D och E huvudsakligen orange fluorescens, vilket tyder på närvaro av aktivt metaboliserande levande tandbakterier. Som framgår av bilden har den lossnade biofilmen från tänderna behållit sin biofilmidentitet och uppträder som mikrobiella mattor när det gäller kontrollen. GT 0-behandlingen resulterade i den förväntade avdödande effekten av grönt te (fig. 5 b) för alla frivilliga. De grönt fluorescerande områdena (döda celler) dominerade, med områden med orange fluorescens som fanns med bland dem. Panel (c) visar resultaten från 5K-S supernatanten från GT 3, där de största partiklarna av grönt te avlägsnades från extraktet. Som framgår av de fluorescensmikroskopiska bilderna observerades ingen orange fluorescens och fullständig grön fluorescens, vilket tyder på att tandbakterierna/biofilmen är helt utplånade. Det var också intressant att observera att inga biofilmsfläckar eller mattor längre observerades, biofilmsmattorna upplöstes och allt som sågs var spridda cellklumpar i alla testprover (A(c), B(c), C(c), D(c) och E(c)). Slutligen visas i figur 5 d resultaten av 20K-S-interaktionen, där en betydande minskning av det gröna teextraktets dödande effekt är uppenbar. Förekomsten av orange fluorescerande levande bakterieceller tyder på en minskning av extraktets antimikrobiella aktivitet när nanokomponenterna från grönt te avlägsnas. Även om gröna fluorescerande döda celler också observeras verkar förhållandet mellan levande/döda celler ha förändrats. Dessa resultat bekräftar den trend som rapporterats via spektrofotometrisk metod och platträkningsmetod för antimikrobiell aktivitet hos de olika testkomponenterna i grönt te.
Epifluorescensmikrograf som visar den levande/döda karaktären hos den orala biofilmen från (A) Volontär 1 (B) Volontär 2 (C) Volontär 3 (D) Volontär 4 i (a) Kontroll (ingen GT-komponent) (b) GT 0 (c) 5K-.S (d) 20K-S som tillhör GT 3.
FE-SEM-observation av kontrollbakterier och tandbakterier som interagerat med 5K-S visas i figur 6 (a-c). Som framgår av figuren visar kontrollen (fig. 6(a)) en välutvecklad biofilm (Volunteer 4), medan GT 0 (fig. 6(b)) av GT 3 och 5K-S (fig. 6(c)) interaktion resulterade i att cellerna och biofilmen skadades, vilket indikeras av cellrester. Bilder tagna med CLSM (d) visar att en stor majoritet av tandbakterierna från alla fem frivilliga dödades av GT 3 (5K-S). GT 3-GT 0 och 5K-S visade sig vara de mest lovande mot tandbakterierna från alla frivilliga.
FE-SEM-bilder av tandprover från V4 (a) kontroll (obehandlat) (b,c) GT 3 behandlat, som visar omfattande skador efter inkubation med grönt te. (d) visar CLSM-bilder av cellerna, de fluorescerande cellerna representerar de döda cellerna hos de fem olika frivilliga efter behandling med GT 3 20K-P:s.
Karakterisering av extrakt och partiklar
Med resultaten från bioaktivitetstesterna baserade på den antibakteriella aktiviteten hos komponenterna i grönt te som visar att närvaron och frånvaron av partiklar från grönt te faktiskt förändrar extraktets aktivitet, är det nödvändigt att extrakten GT 0, 5K-S, 10K-S och 20K-S och sedan partiklarna 5K-P, 10K-P och 20K-P från de tre gröna teerna karakteriseras utförligt.
Biokemisk karakterisering
Antibakteriell aktivitet styrs i allmänhet av ett extrakts totala fenoler, flavanoider och antioxidativa förmåga. Alla dessa parametrar studerades och jämfördes bland de extrakt och partiklar som användes i denna studie. Figur 7(a) visar de resultat som erhållits för GT 1. När det gäller flavanoider observerades, som framgår av grafen, inte någon större skillnad i flavanoidinnehållet mellan extrakten GT 0, 5K-S, 10K-S och 20K-S. GT 0 tycktes uppvisa en marginell ökning jämfört med de övriga. När det gäller partiklarna av grönt te uppvisade 5K-P det högsta flavanoidinnehållet, medan 10K-P och 20K-P följde med liknande halter av flavanoider som de som fanns i extrakten. I GT 2 Fig. 7(b) och GT 3 Fig. 7(c) var flavanoidinnehållet annorlunda, 5K-S och 10K-S extrakten uppvisade högst flavanoidinnehåll jämfört med GT 0. Partiklarna 5K-P och 10K-P uppvisade ett mycket lågt flavanoidinnehåll. Undantagen var att 20K-S-extrakten visade mindre flavanoider jämfört med de andra extrakten och 20K-P-partiklarna visade högre flavanoider jämfört med de andra partiklarna.
Genomgång av de biokemiska aktiviteterna hos (a) GT 1 (b) GT 2 och (c) GT 3-komponenterna baserat på deras antioxidantaktivitet (med hjälp av DPPH), flavonoidinnehåll (AlCl3-metoden) och totala fenoliska ämnen (Folins metod).
Med avseende på de totala fenolerna i GT 1 hittades det högsta värdet i GT 1 i GT 0, medan de övriga visade lägre värden. När det gäller GT 2 och GT 3 observerades dock återigen en liknande trend när det gäller fenolinnehållet, där alla extrakt uppvisade nästan likartade fenolhalter. Men 5K-P och 10K-P uppvisade minst fenoliska innehåll jämfört med 20K-P.
I fråga om antioxidativ aktivitet uppvisade GT 1-extrakten (GT 0, 5K-S, 10K-S och 20K-S) mycket hög antioxidativ aktivitet, medan 5K-P och 10K-P uppvisade sex gånger lägre antioxidativ aktivitet. Det måste dock nämnas här att 20K-P visade betydligt högre antioxidativ aktivitet jämfört med 5K-P och 10K-P. I GT 2 och GT 3 var denna trend mer uttalad, där 5K-S och 10K-S uppvisade högre antioxidativ aktivitet jämfört med GT 0. Men en tydlig minskning av den antioxidativa aktiviteten observerades när det gäller 20K-S med en motsvarande ökning av aktiviteten i 20K-P i GT 2 och GT 3. Det bör noteras att bland de tre studerade gröna teerna uppvisade GT 3 högre värden för dessa bioaktiva föreningar, tätt följt av GT 2, och slutligen låg GT 1 långt efter. Denna trend korrelerar starkt med den antimikrobiella bioaktiviteten hos de gröna teerna som var i ordningen GT 3 > GT 2 > GT1.
FE-SEM-analys
Partiklarna 5K-P, 10K-P och 20K-P avbildades med hjälp av FE-SEM för deras morfologiska detaljer och storlekar. Figur 8 visar 5K-P (a), 10K-P (b) och 20K-P (c) morfologin hos partiklarna från GT 1 (A), GT 2 (B) och GT 3 (C). Oregelbundna morfologier utan tydlig form observerades i de flesta fall. Som framgår av figur 8 observerades 5K-P-partiklarna i GT 1 och GT 2 vara makrostora, och det är dessa partiklar som vi ser synligt i vår kopp grönt te. I tabell 1 visas deras storlekar, GT 2 (B) 5K-P-partiklar var de största (50-80 μm), följt av GT 1 (B(a)) som låg i storleksintervallet 15-25 μm. GT 3 5K-P-partiklarna var relativt sett mindre, i storleksordningen 6-30 μm (fig. 8(C(a))). Som observerades i mikrograferna hade partiklarna inte fasta storlekar, vilket förväntas av sådana grova ostandardiserade kommersiella prover. 10K-P-partiklarna var i mikrostorleksintervallet 4-10 μm för GT 1 (A(b)), GT 2 var 2-10 μm (fig. 8B(b)) och GT 3 i storleksintervallet 0,5-3 μm (C(b)). 20K-P-partiklarna var mindre mikro- till nanostorlek, med GT 1-partiklar i storleksordningen 0,5-6 μm (A(c)), GT 2-partiklar (B(c)) var 200-540 nm och GT 3-partiklar (C(c)) var de minst stora och fanns i storleksordningen 50-300 nm. Som framgår av dessa resultat observerades 20K-P-partiklar som hade förbättrade bioaktiva komponenter och som visade antioxidativa och antibakteriella egenskaper i en nära-nanoregim.
FE-SEM-mikrografer av (a) 5K-P, (b) 10K-P och (c) 20K-P av GT 1 (A), GT 2 (B) och GT 3 (C), som visar de extraherade partiklarnas morfologi och storlek. Insatserna visar optiska mikrobilder av motsvarande partiklar.
UV-Vis-spektrofotometri
Figur 9 visar UV-Vis-spektrumet för extrakten och partiklarna som karakteriserats för deras EGCG-innehåll. Atomssa & Gotlap 201539 har rapporterat absorbansen för katekinfamiljen: EGCG visar en absorbans i intervallet 248-361 nm i vatten med λmax vid 273,6 nm; ECG 246- 363 nm λmax vid 276,8 nm; spektralområdet för EGC i vatten är 254-378 nm och λmax vid 269,6 nm och det för EC är 252-328 nm med λmax vid 278,4 nm. Som observerats i figur 9 a GT-1 ser vi bara absorptionstoppen för EGCG vid 273 nm. När det gäller EGCG-toppen observerades ingen skillnad inom extrakten (GT 0, 5K-S, 10K-S och 20K-S). När det gäller partiklarna av grönt te observerades dock att 20K-P-partiklarna uppvisade en signifikant ökning av EGCG-intensiteten jämfört med 5K-P och 10K-P. Det var intressant att observera att 20K-P:s innehöll nästan 50 % EGCG i extrakten.
UV- Synliga spektrum av de olika komponenterna i grönt te som användes som testvariabler i denna studie.
För GT 2 observerades att extrakten uppvisade förekomst av andra toppar från katekinfamiljen i intervallet 248-363 nm, vilket observerades från de olika topparna i detta intervall i figur 9(b). När partiklarna avlägsnades från extraktet ledde det till förskjutningar i topparna. Särskilt extrakten uppvisade tydliga förskjutningar. När det gäller partiklarna 5K-P och 10K-P observerades dock att de endast uppvisade EGCG-toppar med låg intensitet. Här betonas 20K-P-partiklarna som uppvisade catechintoppar med nästan samma intensitet som extrakten. Det observerades att till skillnad från 5K-P och 10K-P visade 20K-P-partiklarna inte bara EGCG-toppar utan även de andra topparna i katekinfamiljen, ganska lika som extrakten.
GT 3 (fig. 9(c)), extrakten gav olika toppar, inklusive katekintopparna. Jämfört med GT 1 och GT 2 uppvisade dock 5K-P- och 10K-P-partiklarna själva EGCG-toppar med hög intensitet. Trenden att 5K-P- och 10K-P-partiklarna endast uppvisade EGCG-toppar fortsatte att gälla även i GT 3. 5K-P visade högre EGCG jämfört med sina motsvarigheter i GT-1 och GT 2, men jämfört med 10K-P i GT 3 var den mycket lägre. 10K-P av GT 3 visade EGCG-innehåll som liknade det i extrakten. 20K-P:erna uppvisade i detta fall de högsta katekintopparna och överträffade även extrakten. Förskjutningar av topparna observerades liknande dem som rapporterats inom vattenextraktion och lösningsmedelsextraktion när det gäller 20K-P:s jämfört med extrakten. Det var intressant att notera att 20K-P:s toppar var smalare och av hög intensitet. En exceptionellt hög topp vid 269 nm som motsvarar EGC observerades i 20K-P:erna. Med den allmänna observationen att 20K-P:s innehöll signifikant stora mängder katekiner i GT-1, GT 2 och GT 3 bekräftades via dessa studier.
FT-IR
FT-IR-spektrumet som erhållits från partiklarna 5K-P, 10K-P och 20K-P av GT 3 som uppvisade den maximala antibakteriella aktiviteten och de unika egenskaperna presenteras i fig. 10(a). Spektren stämmer överens med det karakteristiska bandet för EGCG. Ponnuraj et al, 201540 rapporterar EGCG-fingeravtryck vid 3357,46 cm-1 för O-H-gruppen som är knuten till den aromatiska ringen, 1691,27 cm-1 och 1616,06 cm-1 starka för C = O-gruppen som binder trihydroxybenzoatgruppen och kromangruppen, 1447,31 cm-1 för C-H-gruppen som finns i kromangruppen, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 för O-C = O-gruppen, 1148,40 cm-1 för O-H-gruppen, 1041,37 cm-1 för C-O-C-gruppen som binder samman kromanringen och trihydroxybenzoatringen och 825,38 cm-1 för C-H-gruppen i den aromatiska ringen. Det var intressant och stödjande att observera att ett distinkt mönster observerades som en funktion av ökande centrifugering, vilket motsvarar minskande partikelstorlekar. Vid 5K-P var EGCG-banden minst intensiva, följt av 10K-P och 20K-P som visade band med hög intensitet. Detta korrelerar med de resultat som observerades även i UV-studierna.
FT-IR-resultat av 5K-P-, 10K-P- och 20K-P-partiklar som isolerats från (a) GT 3; (b) 5K-P och 20K-P från GT 1 och (c) 20K-P-nanopartiklar som isolerats från GT-1, GT 2 och GT 3.
Figur 10(b) visar de FT-IR-spektra som erhållits från GT 1 5K-P och 20K-P, När det gäller GT 1 fanns det inte någon större skillnad i EGCG-banden mellan de två partiklarna. Dessa resultat stämmer överens med de resultat som observerades även vid de UV-spektrofotometriska studierna. I figur 10 c visas de jämförande spektrumen för 20K-P från GT 1, GT 2 och GT 3. Gradientmönstret med ökade EGCG-band i ordningen GT 1 < GT 2 < GT 3 är tydligt.