Non-organoid Approaches
Hittills har tarmepitelcellinjer varit de främsta in vitro-modellsystemen för att utvärdera intestinala transportprocesser, medan enteroendokrina cellinjer är vanliga modeller för att studera utsöndringen av olika tarmhormoner. En etablerad modell för enterocyter i tunntarmen är cellinjen CaCo-2 (eller CaCo-2 TC7-subklonen), som härstammar från ett adenokarcinom i tjocktarmen. Denna cellinje odlas vanligen på transwellplattor upp till tre eller fyra veckor efter konfluens för studier av intestinal transport av näringsämnen, läkemedel eller andra föreningar med hjälp av radiomärkta eller fluorescensmärkta substrat (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang och Li, 2017). HT-29-cellerna (och subkloner) är en mänsklig kolonkarcinomcellinje som är väletablerad för forskning om intestinala transportörer, särskilt sockertransportörer (Delezay et al., 1995; Liu et al., 2016). För att studera transportörernas roll i tarmens näringsavkänning krävs dock andra cellinjer. De mest framträdande enteroendokrina cellinjerna som används för studier av hormonutsöndring i tarmen är den murina GLUTag-cellinjen (Emery et al., 2015), den murina STC-1-cellinjen (Jiang et al., 2016) och den humana NCI-H716-cellinjen (Pais et al., 2014). Ingen av dem återspeglar dock den komplexa biologin hos enteroendokrina celler in vivo (Kuhre et al., 2016). Enteroendokrina celler är fördelade över hela tunn- och tjocktarmen, och deras uttrycksmönster av olika tarmhormoner skiljer sig mycket åt beroende på var de befinner sig i tarmkanalen (Habib et al., 2012). Till exempel ökar antalet GLP-1-utsöndrande celler (ofta kallade L-celler) gradvis från proximal till distal tarm, medan GIP-utsöndrande celler (kallade K-celler) minskar. Enteroendokrina cellinjer, som alla härstammar från tumörer, utgör således mycket enkla och konstgjorda modellsystem för undersökning av näringssensorik, hormonutsöndring i tarmen och de underliggande molekylära och regulatoriska mekanismerna. Fördelen med däggdjurscellinjer är att de är väletablerade av många laboratorier runt om i världen. Det finns många vetenskapliga data tillgängliga, liksom etablerade experimentella protokoll. Dessutom är de lätta att hantera och odlingen är billig. Ändå är alla dessa cellinjer mycket enkla och konstgjorda modellsystem. De härrör oftast från tumörer och representerar endast en enda celltyp, vilket inte återspeglar komplexiteten hos tarmslemhinnan som består av flera specialiserade celltyper. Dessutom odlas de vanligtvis i två dimensioner, vilket inte återspeglar den tredimensionella arkitekturen hos den naturliga tarmen.
I synnerhet för studier av näringsavkänning och hormonutsöndring i tarmen är primära tarmcellkulturer ett mycket bättre tillvägagångssätt, och har etablerats som en tillförlitlig modell under de senaste åren (Reimann et al., 2008). Primärkulturer som odlas från isolerade tarmkryptor har fördelen att de kan genereras från olika tarmsegment (Parker et al., 2012) och från möss (vildtyp eller knockout-djur) (Diakogiannaki et al., 2013) eller människor (Habib et al., 2013). De omfattar absorberande enterocyter samt olika subtyper av enteroendokrina celler som finns i den inhemska tarmen. Dessa kulturer innehåller dock dåligt differentierade enterocyter och är därför inte lämpliga för detektion av intestinala transportörer och receptorer på protein- eller funktionsnivå. De är ett kortsiktigt odlingssystem som inte lämpar sig för långtidsexperiment, och de kan inte passageras, vilket ökar antalet försöksdjur som behövs för att förbereda odlingarna. Samma sak gäller för isolerade tarmepitelceller (Grossmann et al., 1998), som omfattar alla typer av slemhinneceller, men som uppvisar mycket begränsad livskraft in vitro och inte representerar ett intakt epitel.
Kortsiktig stabilitet är också en begränsning för vävnadsexploaterade material, som t.ex. upprivna tarmringar (Roder et al, 2014), eller tarmsäckar från mus- eller råtttarm (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016) som ofta används för transportstudier. Everted tarmringar kan antingen inkuberas med märkta substrat in vitro eller framställas efter oral administrering av till exempel radiomärkta transportörsubstrat hos gnagare (Roder et al., 2014). Everted gut sacs kan till och med användas för flödesstudier, eftersom de luminala och basolaterala kompartmenten kan riktas separat. Förberedelser och hantering är dock inte triviala och kräver viss erfarenhet. Fördelen med vävnadsexplantat är att de kan framställas från olika tarmsegment och att deras regionspecifika in vivo-egenskaper bevaras in vitro. Tarmsexplantatet behåller sin ursprungliga arkitektur, och slemhinnan är kopplad till den omgivande vävnaden, t.ex. submucosa eller muskler, och neuroner, lymfkärl och blodkärl är inkluderade. Beroende på den vetenskapliga frågan kan detta vara en fördel eller en nackdel. Intestinal avkänning av näringsämnen och efterföljande tarmhormonutsöndring undersöks ibland i perfunderad gnagartarm (Kuhre et al., 2015). Djuret sövs och tarmlumen perfunderas med de förmodade stimulanserna ex vivo. Den basolaterala vätskan samlas upp och tarmhormoninnehållet analyseras. Denna teknik är inte tekniskt enkel, och etiska hinder begränsar den breda användningen av denna metod för studier av näringsinducerad tarmhormonfrisättning.
En tillförlitlig och väletablerad modell som används för studier av funktionella egenskaper och reglering av tarmtransportörer är heterologt uttryck i Xenopus laevis oocyter (Hirsch et al., 1996). Efter mRNA-injektion uttrycks proteinet av intresse i oocyten, och transportkinetiken kan undersökas med hjälp av radioaktivt märkta substrat eller elektrofysiologiska metoder när det gäller elektrogena transportörer (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Denna teknik är ett utmärkt verktyg för att studera funktionella egenskaper hos en viss transportör, även om målproteinet befinner sig i en artificiell miljö och inga reglerande faktorer är närvarande, vilket de skulle vara i däggdjurscellen. Dessutom är tillgången till intakta oocyter och den komplicerade hanteringen, inklusive injektion av oocyter, kritiska frågor som måste beaktas när man tillämpar denna teknik. Mycket enklare heterologa uttryckssystem är jäst och E. coli. De gör det möjligt att generera rekombinanta mutanter som, när de väl har skapats, kan odlas eller fermenteras i större skala och leverera stora mängder protein. Även om dessa mikroorganismer är billiga och lätta att hantera är de mycket förenklade modellsystem för undersökning av däggdjursproteiner, särskilt stora membranproteiner. De problem som ofta uppstår är felveckning av proteinet eller misslyckad membraninsättning. Därför är dessa system snarare mer användbara för strukturell karakterisering av renade proteiner eller proteindomäner (Beale et al., 2015) än för detaljerade studier av däggdjurstransportörers funktion och reglering.
Nya och lovande tillvägagångssätt som har etablerats under den allra senaste tiden är tredimensionella modeller av däggdjurscellkulturer. Intestinala cellinjer som CaCo-2 eller HT-29 odlas på ställningar, vilket skapar en mer tarmliknande arkitektur som leder till förbättrad differentiering (Chen et al., 2015). Andra tredimensionella modeller odlas direkt från humana epitelceller och myofibroblaster i tunntarmen på belagda mikroporösa membran (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b) och kan inte förökas in vitro. Dessa modeller har potential att etableras för transportstudier av näringsämnen eller läkemedel, och kulturer som odlas från humana tarmepitelceller omfattar även olika slemhinnecelltyper, men inte enteroendokrina celler. Samma sak gäller för tredimensionella bioprintade vävnader, en annan teknik som har uppstått mycket nyligen och som har fått enorm uppmärksamhet. Detta tillvägagångssätt är av större värde för regenerativ medicin och transplantation än för experimentell forskning (Murphy och Atala, 2014). Bioprinting av olika vävnader, inklusive hjärta, hud och ben, har framgångsrikt etablerats, men bioprinting av tarmvävnader är hittills sällsynt och måste förbättras ytterligare (Wengerter et al., 2016).