I vår studie, upptäckte vi retrospektivt förekomsten av CALR-mutationer i en kohort av 524 JAK2 V617F-negativa patienter som presenterades med klinisk och/eller laboratoriemässig misstanke om MPN med det huvudsakliga målet att fastställa det diagnostiska värdet av denna upptäckt. Under den observerade perioden hade CALR-mutationer inte undersökts rutinmässigt hos patienter som misstänktes för MPN i vårt centrum, eftersom de upptäcktes först nyligen1,2. Däremot har JAK2 V617F-mutationen redan analyserats rutinmässigt sedan den upptäcktes 200520. Därför uteslöts JAK2 V617F-positiva patienter från studien. En MPL-mutation är ett relativt sällsynt fynd hos MPN-patienter och förekommer oftast hos patienter med antingen ET eller PMF21. I vårt laboratorium inkluderades MPL-testning i den diagnostiska algoritmen hos patienter med misstänkt MPN först nyligen och utförs först efter uteslutning av JAK2 V617F- och CALR-mutationer. Därför definierades inte MPL-status hos alla våra patienter vid den första undersökningen.
Vårt centrum är ett medicinskt universitetssjukhus som betjänar ett område med cirka 1 000 000 invånare och är ett remisscentrum för hematologiska maligniteter. Alla patienter som remitterades till hematologiavdelningen utvärderades först av allmänläkare utan ingående kunskaper inom området hematologiska maligniteter. Som framgår av tabell 3 var det endast en del av de patienter som hänvisades till hematologiavdelningen som hade patologiska kliniska och/eller laboratorieparametrar som var misstänkta för MPN vid tidpunkten för den första undersökningen. Därför var de flesta patienter som hänvisades till hematologiavdelningen individer utan hematologisk malignitet, eftersom vi fastställde att 380 patienter (380/524 = 72,5 %) var MPN-fria. Dessa patienter diagnostiserades med sekundära förändringar i det perifera blodinnehållet som orsakades av olika tillstånd, t.ex. järnbrist, infektions- och inflammatoriska sjukdomar, hyposplenism, malignitet, rökning, nyligen genomförda operationer, användning av kortikosteroider och kronisk hypoxi. Följaktligen var antalet CALR-positiva patienter i vår kohort lågt. Vi identifierade 4,4 % av de patienter som misstänktes för MPN som CALR-positiva, varav de flesta diagnostiserades med antingen ET eller PMF. De flesta liknande studier analyserade antalet CALR-positiva patienter med bekräftad MPN; därför var antalet CALR-positiva patienter mycket högre, från 12 till mer än 20 %22,23,24,25,26. Baserat på våra uppgifter skulle det vara fördelaktigt att förbättra det diagnostiska tillvägagångssättet för patienter med förhöjda nivåer av en eller flera blodcellslinjer, eftersom detta i de flesta fall inte orsakas av hematologisk malignitet. Patienterna bör rutinmässigt screenas för de vanligaste orsakerna till sekundär erytrocytos, trombocytos och leukocytos, och blodstatusen bör upprepas minst en gång vid uppföljningsbesök innan de remitteras till hematologiavdelningen. Molekylärgenetisk testning bör reserveras för patienter med hög misstanke om klonal hematologisk sjukdom och inte utföras på alla patienter som remitteras till hematologiavdelningen.
CALR-mutationer identifieras ofta hos JAK2 V617F-negativa patienter med ET1,2. Vid vårt centrum var det endast en minoritet av CALR-positiva patienter (7/23 = 30 %) som diagnostiserades med ET enligt 2008 års WHO-kriterier vid den första undersökningen. Det främsta skälet till detta var den relativa reservationen mot benmärgsundersökning hos patienter med måttlig trombocytos och låg risk för trombotiska komplikationer. Detta innebär dock att vi kan ha underskattat antalet patienter med klonal trombocytos. Genom att bekräfta förekomsten av CALR-mutationer kunde vi retrospektivt diagnostisera 9 patienter med ET enligt de modifierade WHO-kriterierna för ET13. Även om alla dessa patienter följdes upp på vår avdelning på grund av hög misstanke om klonal trombocytos är det av stor prognostisk och terapeutisk nytta att kunna bekräfta diagnosen ET genom ett icke-invasivt förfarande som molekylärgenetisk testning. CALR-mutationer är därför viktiga diagnostiska kännetecken för ET, vilket också nyligen har bekräftats i litteraturen27,28.
Alla patienter med PMF diagnostiserades enligt WHO-kriterierna vid undersökningstillfället på hematologiavdelningen. Identifiering av CALR-mutationer bekräftade retrospektivt diagnosen men hade ingen direkt diagnostisk eller terapeutisk inverkan.
CMML är en subtyp av MDSs/MPNs och inte strikt MPNs12. CALR-mutationer hos patienter med CMML är extremt sällsynta och spelar ingen viktig roll i dess patogenes. En gruppstudie av Zamora et al. visade att endast 1 av 174 patienter med CMML uppvisade en CALR-mutation29. Patienten i vår studie som diagnostiserades med CMML typ ett och senare utvecklades till myelofibros kan ha blivit feldiagnostiserad vid den första undersökningen, eftersom PMF och CMML har många gemensamma drag, bland annat monocytos och benmärgsfibros. I en nyligen genomförd studie av Hu et al. gjorde en noggrannare analys att många patienter som diagnostiserats med CMML kunde omklassificeras till att ha PMF, vilket visar att en mer djupgående analys bör utföras för att ställa en korrekt diagnos, särskilt hos patienter med molekylära biomarkörer som är typiska för ET/PMF11,30.
Mer än 50 ramförskjutningsmutationer i CALR har beskrivits, och alla är lokaliserade i exon 9 av CALR-genen. Det finns två huvudtyper av CALR-mutationer: typ 1 (en 52-bp-deletion; p.L367fs*46) och typ 2 (en 5-bp TTGTC-insättning; p.K385fs*47). Baserat på deras molekylära egenskaper kan andra mutationer grupperas som typ 1-lika och typ 2-lika31. I vår studie var den vanligaste typen av CALR-mutation typ 1, vilket stämmer överens med uppgifter från litteraturen2,16,32. Mutationer som varken är typ 1 eller typ 2 bör underklassificeras som typ 1-lika eller typ 2-lika, eftersom detta kan ha en inverkan på den kliniska fenotypen och, när det gäller PMF, även på överlevnaden17. Typ 1-lika och typ 2-lika mutationer i vår studie definierades med hjälp av AGADIR15, en statistisk approximationsalgoritm som beräknar spiralbenägenheten för de 31 unika aminosyrasekvenser som förändras av CALR-mutationer16. Denna algoritm har använts i liknande studier och utgör ett viktigt verktyg för subklassificering av CALR-mutationer16,17. Det verkar ytterst viktigt att korrekt definiera typen av CALR-mutation, eftersom detta också har en diagnostisk inverkan. Det är känt att endast mutationer som leder till en + 1 (-1 + 2) ramförskjutning av läsramen är patogena6. Andra CALR-mutationer kan vara germina varianter av CALR med okänd klinisk betydelse. I vår studie upptäcktes CALR-mutationer som inte är ramförskjutningar hos två patienter. En av dessa patienter diagnostiserades med reaktiv trombocytos vid undersökningstillfället på hematologiavdelningen och definierades retrospektivt som CALR-positiv. En detaljerad analys bekräftade en missense CALR-mutation som resulterar i att glutaminsyra byts ut mot asparaginsyra vid aminosyraposition 398. Samma mutation upptäcktes hos en patient med WHO-definierad kronisk neutrofil leukemi (CNL) i en studie av Lasho et al. I hans studie drogs slutsatsen att CALR-mutationer som inte leder till att en distinkt C-terminus bildas tyder på en annan patogen mekanism som kanske ännu är okänd33. I vår studie antog vi att vår patient inte utvecklade en CALR-mutation som skulle innebära en klonal hematologisk sjukdom. Enligt patientens anamnes, kliniska undersökning och laboratoriefynd var det mest som tyder på reaktiv trombocytos. När denna artikel skrevs var patienten vid god hälsa utan några möjliga komplikationer i samband med klonal hematologisk sjukdom.
En annan patient med en icke-frameshift CALR-mutation diagnostiserades med MPN-U. Denna patient bar på en germline in-frame-deletion i CALR-genen (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), som redan hade uppmärksammats hos en symtomatisk patient med MPN34. Även om KDEL-motivet bevarades ledde deletionen av en aminosyra (p.(Glu381del)) till en förändring av proteinets sekundärstruktur samt av den tredimensionella strukturen, vilket ledde till slutsatsen att denna inframe-deletion var patogen23,34,35. Vår patient med MPN-U förlorades tyvärr i uppföljningen, och en exakt hematologisk diagnos eller eventuella komplikationer kunde inte fastställas. Laboratoriefynd tyder dock på en klonal hematologisk sjukdom.
I vår studie upptäckte vi fyra nya CALR-mutationer i exon 9 som, såvitt vi vet, ännu inte har registrerats i COSMIC- (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) eller HGMD-databasen (http://www.hgmd.cf.ac.uk). COSMIC-databasen är världens största expertkurerade databas över somatiska mutationer i mänsklig cancer. Den beskriver över 4 miljoner kodande mutationer36. HGMD-databasen är ett försök att sammanställa alla kända (offentliggjorda) genförändringar som är ansvariga för mänskliga ärftliga sjukdomar19. De nya mutationer som definierades i vår studie är NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47) och NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Alla dessa mutationer var typ 2-lika mutationer.
ET och PMF är förknippade med en ökad risk för trombotiska och tromboemboliska händelser, som utgör viktiga orsaker till sjuklighet och dödlighet37. Att minska risken för trombotiska och tromboemboliska komplikationer är ett av de viktigaste målen för behandlingen, särskilt hos patienter med ET38. Dessa patienter löper också högre risk för blödningskomplikationer, som kan vara relaterade till behandlingskomplikationer eller förvärvat von Willebrands syndrom (AVWS) på grund av extrem trombocytos (trombocyter > 1000 × 109/L)28,39,40. Risken för trombos hos patienter med ET överstiger 20 %41. I en svensk studie utvecklade 35 % av patienterna med ET vaskulära komplikationer42. Vid PMF är trombotiska händelser ungefär lika vanliga som vid ET43. Prevalensen för trombotiska komplikationer hos patienter med PMF varierar mellan 7 och 30 %44,45,46. I vår studie var prevalensen av trombotiska komplikationer hos CALR-positiva patienter 30 %. Tre patienter hade dock utvecklat en trombotisk komplikation mer än 10 år innan MPN-diagnosen misstänktes. Den verkliga prevalensen av trombotiska komplikationer i vår studie var därför lägre. En patient utvecklade glaskroppsblödning som var ett resultat av otillräcklig antikoagulationsbehandling med warfarin. Ingen av de två patienterna med en blödningskomplikation hade extrem trombocytos vid tidpunkten för komplikationen. Jämfört med JAK2 V617F- och MPL-mutationer är CALR en gynnsam mutation och förknippas med en lägre incidens av trombotiska händelser1,2,47. De flesta CALR-positiva patienter som utvecklade trombohärmorragiska komplikationer diagnostiserades med typ 1-mutationer (71,4 %). Som redan visats hade patienter med typ 1-lika mutationer en högre risk för trombos jämfört med patienter med typ 2-lika mutationer10.
CALR-mutationer är för närvarande kända för att vara en av de tre viktigaste mutationstyperna, utöver JAK2 V617F och MPL-mutationen, hos patienter med ET eller PMF. Det fanns dock fortfarande 10-15 % av patienterna med ET eller PMF med en okänd molekylär genetisk markör som låg till grund för sjukdomen. Dessa patienter kallas ”trippelnegativa ”48. Hos dessa patienter har man sökt efter nya molekylära biomarkörer genom att sekvensera kodande exoner i myeloiska cancergener, vilket har gett lovande resultat. Detta kan ge ett personligt tillvägagångssätt för diagnostik hos patienter med MPN49.
CALR-mutationer hos MPN-patienter undersöks också med avseende på deras terapeutiska potential50,51,52. CALR-exon 9-mutationer skulle kunna vara mål för immunterapi mot cancer, eftersom de har visat sig fungera som immunogena neoantigen51. Vid behandling av MPN kan det vara fördelaktigt att kombinera CALR-vacciner med immunmodulerande behandlingar53 som interferon-alfa (IFN-α)54 eller programmerad död 1-ligand (PD-L1)55 som en kombinatorisk cancervaccination53. CALR-mutationer kan, förutom att vara viktiga diagnostiska och prognostiska markörer hos patienter med MPN, i framtiden bli ett viktigt terapeutiskt mål i en undergrupp av patienter med MPN.