Laine började inte sjunga professionellt förrän i mitten av tjugoårsåldern. Hennes tidiga influenser som sångerska var Ella Fitzgerald, Sarah Vaughan, Judy Garland och Lena Horne. Vid 24 års ålder provspelade hon framgångsrikt för John Dankworths lilla grupp, Dankworth Seven, och senare för hans orkester, med vilken hon uppträdde fram till 1958. Dankworth och Laine gifte sig samma år i hemlighet på Hampstead Register Office. De enda vittnena var parets vän, pianisten Ken Moule, och Dankworths arrangör David Lindup. Paret fick två barn, som båda är framgångsrika musiker i sin egen rätt: Alec som bor i USA och Jacqui, en brittisk sångerska som har gett ut ett antal album.
Hon spelade huvudrollen i en ny pjäs på Royal Court Theatre i London, hemvist för den nya vågen av dramatiker på 1950-talet som John Osborne och Harold Pinter. Detta ledde till andra scenframträdanden, såsom musikalen Valmouth 1959, pjäsen A Time to Laugh (med Robert Morley och Ruth Gordon) 1962, Boots With Strawberry Jam (med John Neville) 1968 och slutligen till hennes roll som Julie La Verne i Wendy Toyes uppsättning av Show Boat på Adelphi Theatre i London 1971. Show Boat hade sin hittills längsta speltid under den Londonsäsongen med 910 föreställningar.
Under denna period hade hon två stora skivframgångar. ”You’ll Answer to Me” nådde den brittiska topp 10 medan Laine var ”prima donna” i 1961 års Edinburgh Festival-produktion av Kurt Weills opera/balett The Seven Deadly Sins, regisserad och koreograferad av Kenneth MacMillan. 1964 fick hennes album Shakespeare and All that Jazz med Dankworth ett gott mottagande. Dankworth och Laine grundade Stables theatre 1970 i det som var det gamla stallbyggnaden på deras hems tomt. Det blev en omedelbar succé, med 47 konserter under det första året.
Laines internationella verksamhet inleddes 1972 med en framgångsrik första turné i Australien, där hon släppte sex topp-100-album under hela 1970-talet. Kort därefter inleddes hennes karriär i USA med en konsert i New Yorks Lincoln Center, som 1973 följdes av den första av många Carnegie Hall-framträdanden. Snart följde turnéer från kust till kust i USA och Kanada och med dem en rad skivalbum och tv-framträdanden, bland annat i The Muppet Show 1977. Detta ledde, efter flera nomineringar, till hennes första Grammy-pris, som ett erkännande för liveinspelningen av hennes Carnegie-konsert från 1983. Hon har fortsatt att turnera med jämna mellanrum, bland annat i Australien 2005.
Hon har samarbetat med James Galway, Nigel Kennedy, Julian Lloyd Webber och John Williams. Andra viktiga inspelningar under denna tid var duettalbum med Ray Charles (Porgy and Bess) samt Arnold Schönbergs Pierrot Lunaire, för vilken hon fick en Grammy Award-nominering.
Laines förhållande till musikteatern började i Storbritannien och fortsatte i USA med huvudrollsinnehav i Sondheims A Little Night Music och Franz Lehárs The Merry Widow (Michigan Opera). År 1980 spelade hon huvudrollen i Colette, en musikal av Dankworth. Föreställningen började på Stables theatre, Wavendon, 1979 och flyttades till Comedy Theatre, London, i september 1980. År 1985 gjorde hon rollen som Princess Puffer i Broadway-musikalen The Mystery of Edwin Drood, för vilken hon fick en Tony-nominering. År 1989 fick hon Los Angeles kritikerros för sin gestaltning av häxan i Sondheims Into the Woods.
I maj 1992 uppträdde Laine tillsammans med Frank Sinatra under en veckas konserter i Royal Albert Hall i London.
I slutet av 1990-talet sålde Laine ut sina konserter över hela världen, oftast med stöd av Dankworth med sitt band, sin orkester eller en mindre grupp. Hennes vanliga band bestod av John Horler (piano), Alec Dankworth (bas), Allan Ganley (trummor) och Mark Nightingale (trombon).
Laines självbiografi, Cleo, publicerades i september 1994 av Simon & Schuster. Hennes andra bok, You Can Sing If You Want To, publicerades av Victor Gollancz i oktober 1997. År 2000 medverkade hon som sångerskan Gwen i filmen The Last of the Blonde Bombshells.
I 1997 års nyårshonorarlista blev Laine en Dame Commander, och hon utnämndes till Dame Cleo Laine DBE. I 2006 års nyårslista över hedersbetygelser utnämndes hennes make till riddare och blev Sir John Dankworth. De var ett av de få par där båda partnerna hade sina titlar i egen rätt och det enda paret inom jazzen som erkändes på detta sätt.
Dankworth avled den 6 februari 2010, timmar före en planerad konsert på Stables teater i Wavendon för att fira platsens 40-årsjubileum. Han hade varit sjuk i flera månader efter en konsertresa i USA. Trots sin sorg uppträdde Laine på konserten till 40-årsjubileet, tillsammans med John Dankworth Big Band och flera familjemedlemmar – och meddelade hans död först i slutet av konserten. Laines beslut att uppträda figurerade på tidningarnas förstasidor över hela världen, inklusive ett helt fotografi av henne på The Times förstasida.
En vecka efter Dankworths död trädde Laine in som ersättare för sin avlidne make och uppträdde återigen på en konsert i Pinner i nordvästra London. Laine fortsatte att uppträda och ge intervjuer under månaderna efter Dankworths död. Hon uppträdde som huvudnummer på festivalen Music in the Garden i Wavendon i juni och juli 2010.
I mars 2010 släpptes Laine och Dankworths sista musikaliska samarbete på CD och för nedladdning – Jazz Matters. Inspelningen innehöll Dankworth Big Band som spelade nya kompositioner skrivna av Dankworth för parets framträdande vid 2007 års Proms i Royal Albert Hall.
Laine är berömd inte bara för sin tolkningsstil, utan också för sitt omfång på nästan fyra oktaver och sin röstliga anpassningsförmåga. Förutom att hon når djupa souliga toner har Laines scatting och toppnoter blivit hennes signum. Även om hennes naturliga omfång är det av en alt, kan hon producera ett G över högt C. Derek Jewel från Sunday Times kallade henne ”helt enkelt den bästa sångerskan i världen”
.