En chimär var en varelse i grekisk mytologi som vanligtvis framställs som en sammansättning av ett lejon, en get och en orm. Dagens användning av termen ”chimärism” inom hematopoetisk celltransplantation härstammar från denna idé om en ”blandad” entitet och avser en person som har fått en transplantation av genetiskt olika vävnader. Ett test för chimärism efter en hematopoietisk stamcellstransplantation innebär att man identifierar mottagarens och donatorns genetiska profiler och sedan utvärderar omfattningen av blandningen i mottagarens blod, benmärg eller annan vävnad.
Testning av chimärism (analys av engraftment) med hjälp av DNA använder sig av en metodik som vanligen används vid testning av mänsklig identitet och som åstadkoms genom analys av genomiska polymorfismer, så kallade short tandem repeat (STR) loci. Dessa loci består av en kärn-DNA-sekvens som upprepas ett variabelt antal gånger inom ett diskret genetiskt lokus. Termen STR, även kallad mikrosatelliter, avser antalet baspar i en tandemvis upprepad kärn-DNA-sekvens som är mellan 2 och 8 baspar lång. Dessa loci uppvisar alleler som kan skilja sig i längd mellan individer och ärvs som kodominanta mendelska egenskaper. STR-loci har identifierats i hela den mänskliga arvsmassan och vissa loci har mer än 25 alleler.
DNA-sekvensinformation inom lociens bevarade flankerande regioner används för att skapa oligonukleotidprimerpar för STR:erna. Dessa primers används vid PCR-amplifiering (polymeraskedjereaktion) av testprover. Denna teknik kan amplifiera STR-sekvensen så många som en miljard gånger, vilket ger material som kan separeras med en elektroforetisk gel eller genom kapillärelektrofores (CE). Genotypning sker genom utvärdering av DNA-fragmentens storlek. Referens till en allelisk stege kan användas för exakt identifiering av STR-alleler.
Det PCR-baserade STR/CE-systemet har flera fördelar jämfört med andra analysmetoder. Amplifikationen av flera STR-loci kan kombineras (multiplexeras) i ett enda rör, vilket gör det möjligt att analysera upp till sexton loci i en reaktion. Eftersom det krävs små mängder DNA kan prover med lågt cellantal användas, och STR-allelernas ringa storlek gör det till och med möjligt att använda nedbrutna DNA-prover. De digitala uppgifterna underlättar analys och arkivering, och CE-processen är både snabb och kostnadseffektiv. PCR-amplifiering och analys av STR-loci ger en snabb och tillförlitlig metod för utvärdering av graftningsstatus vid stamcellstransplantationer.
Den teknik som för närvarande används möjliggör samamplifiering och trefärgsdetektering av sexton loci som är uppdelade i tre uppsättningar av 5 eller 6 loci som uppvisar amplifierade fragment med icke överlappande storleksintervall.
Under PCR-amplifieringssteget märks de amplifierade fragmenten med fluorescerande färgämnen. Efter PCR-amplifieringen behandlas proverna i ett kapillärelektroforesesystem (CE).
Dataanalysen underlättas av en programvara för fragmentanalys som dimensionerar DNA-fragmenten med hjälp av en intern standard för körning i körfältet tillsammans med provet och tilldelar genotyper genom jämförelse med en STR-allelstege som ingår i CE-körningen. Detta ger distinkta STR-genotypiska profiler för donatorn och för transplantatmottagaren. STR-loci som är polymorfa (dvs. informativa) mellan dessa individer används för att bedöma de relativa mängderna mottagar- och donator-DNA i provet efter transplantationen.
Prover som testas kan komma från vilket material som helst som innehåller DNA, inklusive benmärg, perifert blod, solida tumörer, epidermal vävnad, hårsäckar, munslev, och fraktionerade cellundergrupper. Eftersom PCR-amplifiering av ett prov rutinmässigt utförs med mindre än 2 ng genomiskt DNA (motsvarande cirka 300 celler) kan chimärismtestning med denna metod utföras framgångsrikt även för patienter med misslyckad transplantation, svår leukopeni eller från fraktioner av hematopoetiska cellundergrupper. STR-analys har använts för att utvärdera graftningsstatusen hos patienter som har fått en hematopoietisk celltransplantation, inklusive patienter som har fått dubbla enheter av navelsträngsblod från en donator eller en andra transplantation från en annan donator, samt för att bekräfta den genetiska identiteten hos förmodade identiska tvillingar och för att upptäcka graftning av modercellsavledda celler från inutero hos patienter med diagnosen allvarlig kombinerad immunbrist (SCID). STR/CE-analys är ett snabbt, tillförlitligt, exakt och reproducerbart förfarande.
Begränsningar av testet
- Tillräckligt med DNA måste isoleras från testproverna för att möjliggöra robust PCR-amplifiering. Metoder för DNA-isolering måste finnas tillgängliga för att hantera prover med lågt cellantal, som t.ex. kan förekomma hos mottagare med transplantatfel och från flödescytometriska linjespecifika sorterade delmängder av vita blodkroppar. Proverna kan ha för låga koncentrationer för att kunna kvantifieras med UV-spektrofotometri OD260. DNA-prover från 5 000 till 30 000 isolerade celler ger tillförlitligt en acceptabel amplifiering. Laboratoriet har riktlinjer som definierar när provanalysen bör upprepas.
- Med de kommersiella kitten har många STR-loci informativa alleler för både donator och mottagare vid obesläktade donatorer. Antalet informativa STR-loci kan dock vara begränsat till så få som tre bland transplantationspar med besläktad donator. Kvantitativa värden som representerar medelvärdet av så få som 3 STR loci har visat sig vara reproducerbara.
- Patienter med maligna sjukdomar kan ha klonala mutationer som påverkar vissa STR loci. En patientallel kan saknas på en eller flera STR loci när man jämför de alleler som identifierats i patientens prov före transplantationen med det prov som tagits efter transplantationen. I sällsynta fall kan en extra STR-allel hos patienten upptäckas på ett specifikt locus som inte fanns i provet före transplantationen. I de flesta fall beror dessa anomalier sannolikt på kromosomtranslokationer. Saknade alleler kan också vara resultatet av en mutation inom de STR-konserverade flankerande sekvenserna där PCR-primrarna är placerade. Data från STR-loci med saknade eller extra alleler används inte för kvantifiering.
- Om patientens celler före transplantationen inte finns tillgängliga, kan prover som buccalsvabbar, hudbiopsi eller hårrötter samlas in efter transplantationen. Det bör dock noteras att buccalprover kan innehålla betydande mängder donatorceller.
- Testet är inte avsett för detektion av minimal restsjukdom.
Kliniska indikationer för chimärtestning vid hematopoietisk celltransplantation
Rutinmässig dokumentation efter transplantationen av donatorns/mottagarens ursprung av vita blodkroppar i perifert blod och/eller benmärg. Dokumentation av engraftment kan omfatta testning av linjespecifika cellundergrupper, t.ex. CD3-positiva T-celler och CD33-positiva myeloida celler.
Utvärdera donator-/mottagarceller hos patienter med otillräcklig benmärgsfunktion.
Dekarera om återkommande eller ny malignitet har sitt ursprung i mottagar- eller givarceller.
Bedöm prognostiska risker för avstötning och återkommande malignitet.
Dokumentera persistensen av givarceller efter transplantation hos patienter med återkommande sjukdom eller före donatorlymfocytinfusion (DLI).
Utvärdera om avstötning av transplantatet har inträffat hos mottagare som är kandidater för en andra transplantation.
Differentiera donatorcellernas ursprung hos mottagare som har fått en andra transplantation med en annan donator eller en transplantation med dubbla navelsträngsblodsenheter.
Detektera närvaron av celler som härrör från modern hos patienter som diagnostiserats med svår kombinerad immunbrist (SCID).
Verifiera den genetiska identiteten hos förmodade enäggstvillingar.
Hofta frågor
Fråga: Hur analyseras flera donatorer?
Svar: Det är viktigt att identifiera STR-loci som visar minst en unik STR-allel för patienten och varje donator.
Fråga: Varför testas moderens engraftment?
Svar: Varför testas moderens engraftment?
Svar: Patienter med diagnosen allvarlig kombinerad immunbrist (SCID) kan ha blivit grafiterade med hematopoetiska celler av moderligt ursprung i fosterstadiet. Vissa linjespecifika cellundergrupper (särskilt CD3-positiva celler) kan vara övervägande eller helt och hållet av moderligt ursprung.
Fråga: Vad är skillnaden mellan ”fullständig” och ”blandad” chimärism?
Svar: Vad är skillnaden mellan ”fullständig” och ”blandad” chimärism? ”Full” chimerism används för att hänvisa till en patient som uppvisar en fenotyp efter transplantation i hematopoetiska celler som helt och hållet är av donatorursprung.
”Blandad” chimerism hänvisar till en patient som uppvisar en blandning av patient- och donatorfenotyp i hematopoetiska celler efter transplantation.
Fråga: Vilken typ av chimerism är det? Vad händer om ett baslinjeprov från mottagaren inte finns tillgängligt?
Svar: Det finns flera alternativ för att få ett mottagarprov efter transplantationen: prov från munslev, hårrot eller hudbiopsi kan användas för ett baslinjeprov från mottagaren. Buccal wipe-prover bör användas med försiktighet eftersom donatorceller kan finnas i betydande mängder i buccalprover.
Fråga: Vad händer om ett baslinjeprov från en givare inte finns tillgängligt?
Svar: Om donatorn lever, ta ett nytt blodprov. Om donatorn inte lever bör prover efter transplantationen jämföras med patientens baslinje före transplantationen för att identifiera STR-alleler som upptäcks men som inte har patientens ursprung.
Fråga: Varför är HLA inte ett genomförbart sätt att övervaka engraftment?
Svar: Varför är HLA inte ett genomförbart sätt att övervaka engraftment?
Svar: Transplantatdonatorer väljs för att vara så nära matchade med mottagaren som möjligt. Det finns inga HLA-markörer som skiljer mottagaren och donatorn åt när de är matchade, och endast en eller två om de är felmatchade. Dessutom är andra tekniker ofta känsligare för detta ändamål än övervakning av HLA-missmatchade alleler; följaktligen används andra loci för att ge unika profiler.
Fråga: Vad är ett informativt STR-locus?
Svar: Vad är ett informativt STR-locus?
Svar: Detta är ett locus med minst en allel som är unik för mottagaren eller givaren. För att vara användbar för beräkningar av chimärism måste ett locus ha alleler som är unika för båda. Det kan finnas ett stort antal informativa loci när en obesläktad donator används för transplantationen, men mycket få om ett matchat syskon används. På grund av skillnaderna i amplifieringseffektivitet för allelerna vid varje locus är det att föredra att få fram medel- eller medianvärden från flera loci för att öka noggrannheten. Resultat från enskilda loci är tillförlitligt reproducerbara, så även ett locus kan användas för att trendera sekventiella prover.
Fråga: Vad är lokus ”amelogenin” som ingår i vissa amplifieringspaneler?
Svar: Vad är lokus ”amelogenin” som ingår i vissa amplifieringspaneler? Amelogenin-genen finns på X- och Y-kromosomerna. Det är inte en STR, utan visar olika storlekar på produkterna på respektive kromosom. Detta gör den användbar för att bestämma kön. Den ingår i primerpanelen av kommersiella kitleverantörer som riktar sig till kriminaltekniker där X/Y-differentiering används flitigt. Den används i allmänhet inte för chimärismanalys eftersom den inte kan ge en unik kvinnlig markör (ett manligt prov innehåller alltid en X-allel); den är inte heller användbar vid utvärdering av prover efter en könsmatchad stamcellstransplantation.
Fråga: Hur skiljer sig STR chimerism-analys från genotypning?
Svar: Hur skiljer sig STR chimerism-analys från genotypning?
Svar: ”Genotyp” avser de särskilda alleler som finns i ett visst locus. Genotypning görs för att fastställa profiler för mottagare och givare vid chimärismtestning. När chimärismanalys görs efter en stamcellstransplantation jämförs mottagarens och donatorns genotypiska profiler med provprofilen efter transplantationen för att utvärdera hur mycket av varje komponent som finns närvarande.
Genotypning används också i andra scenarier, t.ex. vid kriminaltekniska undersökningar och släktskapsundersökningar. Rättsmedicinska analytiker använder genotyper för att identifiera källan till bevis i brottmål och för att utesluta personer från att övervägas som misstänkta. De kan också identifiera mänskliga kvarlevor i ”John Doe”-fall och vid masskatastrofer. Föräldraskapsbestämningar görs på ett liknande sätt för att utesluta någon som en möjlig förälder genom att hitta alleler hos barnet som inte matchar vare sig modern eller den förmodade fadern.
Litteratur som citeras/rekommenderad läsning
Bryant E, Martin PJ. Dokumentation av engraftment och karakterisering av chimärism efter hematopoetisk celltransplantation. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hematopoietisk celltransplantation. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.