För amerikanska och kanadensiska besökare, begär ett GRATIS prov på vårt CTAB-baserade SYNERGY™ 2.0 Plant DNA Extraction Kit HÄR.
Det kan vara en stor utmaning att isolera DNA från växtvävnad, eftersom biokemin mellan olika växtarter kan vara extrem. Till skillnad från djurvävnader där samma vävnadstyp från olika arter vanligtvis har liknande egenskaper, kan växter ha varierande nivåer av metaboliter och strukturella biomolekyler. Polysackarider och polyfenoler är två klasser av växtbiomolekyler som varierar kraftigt mellan olika arter och är mycket problematiska vid isolering av DNA. Kontaminerande polysackarider och polyfenoler kan störa manipulationer av DNA efter isolering.
Metoder finns tillgängliga som effektivt avlägsnar polysackarider och polyfenoler från växt-DNA-preparat. Användningen av CTAB (cetyltrimetylammoniumbromid), ett katjoniskt tvättmedel, underlättar separationen av polysackarider under reningen medan tillsatser, såsom polyvinylpyrrolidon, kan hjälpa till att avlägsna polyfenoler. CTAB-baserade extraktionsbuffertar används ofta vid rening av DNA från växtvävnader.
Ett alternativ för rening av DNA med hjälp av CTAB utnyttjar att polysackarider och DNA har olika löslighet i CTAB beroende på koncentrationen av natriumklorid. Vid högre saltkoncentrationer är polysackarider olösliga, medan DNA är olösligt vid lägre koncentrationer. Genom att justera saltkoncentrationen i lysat som innehåller CTAB kan polysackarider och DNA följaktligen fällas ut på olika sätt.
Polyphenoler är föreningar som innehåller mer än en fenolring (t.ex. tannin), en struktur som binder mycket effektivt till DNA. De förekommer naturligt i växter, men bildas också när växter har vävnadsskador (brunfärgning). Vid homogenisering av växtvävnad syntetiseras polyfenoler av frigjort polyfenoloxidas. Tillsatsen av polyvinylpyrrolidon förhindrar interaktion mellan DNA och fenolringar genom att binda upp polyfenolerna.
CTAB-baserade protokoll brukar fungera mycket bra, men en betydande nackdel är att kloroformextraktioner rutinmässigt används för att separera organiska lösliga molekyler från DNA. Eftersom kloroform är cancerframkallande är det många institutioner som inte vill använda det. OPS Diagnostics har därför utvecklat en alternativ metod som undviker kloroform; den finns på sidan Synergy™ Plant DNA Extraction Kit.
Material
- CTAB-buffert: 2 % cetyltrimetylammoniumbromid, 1 % polyvinylpyrrolidon, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, eller CTAB-extraktionsbuffert
- Centrifugering (upp till 14 000 x g)
- RNas A-lösning
- Isopropanol
- 70% etanol
- 2 ml centrifugeringsrör
- SpeedVac
- TE-buffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Metod
Växtprover kan framställas genom kryogenisk malning av vävnad i en mortel och en stöt efter nedkylning i flytande kväve. Frystorkade växter kan malas i rumstemperatur. I båda fallen är ett fint pulver bäst för extraktion av DNA.
- För varje 100 mg homogeniserad vävnad används 500 µl CTAB-extraktionsbuffert. Blanda och virvela ordentligt. Överför homogenatet till ett 60°C-bad i 30 minuter.
- Efter inkubationstiden centrifugera homogenatet i 5 minuter. vid 14 000 x g.
- Överför supernatanten till ett nytt rör. Tillsätt 5 µl RNaslösning A och inkubera vid 37 °C i 20 minuter
- Tillägg en lika stor volym kloroform/isoamylalkohol (24:1). Vortex i 5 sekunder och centrifugera sedan provet i 1 minut vid 14 000 x g för att separera faserna. Överför den vattenhaltiga övre fasen till ett nytt rör. Upprepa denna extraktion tills den övre fasen är klar.
- Överför den övre vattenhaltiga fasen till ett nytt rör. Precipitera DNA:t genom att tillsätta 0,7 volym kall isopropanol och inkubera vid -20 °C i 15 minuter.
- Kentrifugera provet vid 14 000 x g i 10 minuter. Dekantera supernatanten utan att störa pelleten och tvätta därefter med 500 µl iskall 70 % etanol. Häll av etanolen. Avlägsna resterande etanol genom att torka i en SpeedVac.
- Torka pelleten tillräckligt länge för att avlägsna alkoholen, men utan att fullständigt torka DNA:t. Lös DNA i 20 µl TE-buffert (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Pelleten kan behöva värmas upp för att lösas upp.
Ovalprotokoll:
Användning av kiseldioxidspinnkolonner kan ge DNA av högre kvalitet. För ett valfritt protokoll, klicka här.