Sanger-metoden används för att amplifiera ett DNA-målsegment så att DNA-sekvensen kan bestämmas exakt. Införandet av ddNTPs i reaktionsventilerna används helt enkelt för att avsluta syntesen av en växande DNA-sträng, vilket resulterar i delvis replikerade DNA-fragment. Detta beror på att DNA-polymeraset kräver den växande kedjans 3’OH-grupp och den inkommande dNTP:s 5′-fosfatgrupp för att skapa en fosfodiesterbindning. Ibland inkorporerar DNA-polymeraset en ddNTP och avsaknaden av 3’OH-gruppen avbryter kondensationsreaktionen mellan 5′-fosfatet (efter klyvning av pyrofospat) i den inkommande nukleotiden och 3′-hydroxylgruppen i den föregående nukleotiden på den växande strängen. Denna kondensationsreaktion skulle normalt inträffa när DNA-polymeras inkorporerar en icke-modifierad dNTP. Enkelt uttryckt leder den nukleofila attacken av 3′-OH-gruppen till att en nukleotid adderas till en växande kedja. Avsaknaden av 3′-hydroxylgruppen hindrar denna nukleofila attack från att ske, vilket gör det omöjligt för DNA-polymeraset att fortsätta sin funktion.
Denna upptäckt ledde till det lämpliga namnet ”Chain-terminating nucleotides”. Dideoxyribonukleotiderna har ingen 3′ hydroxylgrupp, varför ingen ytterligare kedjeförlängning kan ske när denna dideoxynukleotid väl finns i kedjan. Detta kan leda till att DNA-sekvensen avslutas. Dessa molekyler utgör således grunden för dideoxykedjeavslutningsmetoden för DNA-sekvensering, som rapporterades av Frederick Sanger och hans team 1977 som en utvidgning av tidigare arbete. Sangers metod beskrevs 2001 som en av de två grundläggande metoderna för sekvensering av DNA-fragment (den andra är Maxam-Gilbert-metoden), men Sanger-metoden är både den ”mest använda och den metod som används av de flesta automatiserade DNA-sekvenser”. Sanger fick sitt andra Nobelpris i kemi 1980, och delade det med Walter Gilbert (”för deras bidrag rörande bestämning av bassekvenser i nukleinsyror”) och med Paul Berg (”för hans grundläggande studier av nukleinsyrors biokemi, med särskild hänsyn till rekombinant-DNA”), och diskuterade användningen av dideoxynukleotider i sin Nobelföreläsning.
DNA-sekvenseringRedigera
Dideoxynukleotider är användbara vid sekvensering av DNA i kombination med elektrofores. Ett DNA-prov som genomgår PCR (polymeraskedjereaktion) i en blandning som innehåller alla fyra deoxynukleotider och en dideoxynukleotid kommer att producera strängar med en längd som är lika lång som positionen för varje bas av den typ som kompletterar den typ som har en dideoxynukleotid närvarande. Det taq-polymeras som används i PCR föredrar ddGNTP, vilket har varit ett mönster som observerats i olika undersökningar. Det vill säga, varje nukleotidbas av den typen har en sannolikhet att inte vara bunden till en deoxynukleotid utan snarare till en dideoxynukleotid, vilket avslutar kedjans förlängning. Om provet sedan genomgår elektrofores kommer det därför att finnas ett band för varje längd där komplementet till dideoxynukleotiden finns. Det är nu vanligt att använda fluorescerande dideoxynukleotider så att var och en av de fyra har en annan fluorescens som kan detekteras av en sekvenserare, vilket innebär att endast en reaktion behövs.