En mycket polymorf insättning i Y-kromosomens amelogenin-gen kan användas för evolutionsbiologi, populationsgenetik och könsbestämning hos Cetacea och Artiodactyla

Amelogenin kan användas för molekylär könsbestämning och evolutionsgenetik hos Cetartiodactyla

Amplifiering av det studerade segmentet av amelogeninlocet med hjälp av de artspecifika SC1-SC2-primerna resulterade i en tydlig könsrelaterad storleks-polymorfism hos alla Cetacea (fig. 1) med ett unikt band på 521 bp för honor (två Amel-X-kopior) och ett ytterligare band på 980 bp för Amel-Y hos hanar. Detta mönster var tydligt hos hanar av Baleenvalar (Mysticetes), men det fanns ingen motsvarande Amel-X-amplifiering hos hanar av delfiner, såvida man inte använde primers X5-X6 som härstammar från sekvensen av humant amelogenin. Tidigare studier visade att amelogeninamplifiering var benägen att ge upphov till alleliska bortfall eller åtminstone till preferentiell amplifiering . Dessa fenomen kan förklaras av flera faktorer. Vanligtvis gynnas amplifiering av den mindre stora allelen när mängden polymeras är en begränsande faktor eller vid nedbrytning av mall-DNA . Små mängder DNA kan också öka stokasticiteten i glödningen. Våra resultat överensstämmer dock inte med dessa situationer eftersom den allel som gynnas (Amel-Y) alltid är den största. Å andra sidan kan skillnader i GC-innehåll och felmatchningar i annealingsekvenserna förklara den differentiella amplifieringen. De amelogeninfragment som vi studerade kännetecknas av ett högre GC-innehåll när de amplifieras från X-kromosomen (56 %) än från Y-kromosomen (47 %). Denna skillnad kan bero på att Amel-X-fragmentet inte är inlagt. Denna egenskap samt en 2 bp lång missmatchning mellan delfinens Amel-X och 5′-ändan av den omvända primern SC2 (fig. 2) kan gynna preferentiell amplifiering av Y-kopian hos delfiner (fig. 1b). Om man amplifierar prover från delfinhannar med SC3 (primer utan missmatchning, se fig. 2) i stället för SC2, återställs de två band som ses hos bartendervalar. Förekomsten av denna stora insättning i Amel-Y-kopian kan användas för könsbestämning hos troligen alla valarter.

För att definiera brytpunkterna för Y-placeringen och undersöka dess evolutionära historia sekvenserade vi olika valar (listade i Metoder; sekvenser deponerade under följande accessioner: EMBL:AM744958 till AM744971). Efter anpassning till tillgängliga sekvenser från Artiodactyla (se listan i Metodik) upptäckte vi samma polymorfism i alla andra Cetartiodactyla utom gris (Fig. 3): en 460-465 bp-insättning (storleken är en funktion av indels inom olika individer eller arter) belägen mellan det fjärde och femte exonet (188:e till 651:a positionen i Y-sekvenserna, t.ex. EMBL:AM744958). Haplotypnamn och motsvarande accessioner anges i tabell 1. Sekvenslikheten kontrollerades genom att köra BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) över GenBank nr/nt-nukleotidsamlingssekvenser med megablast-algoritmen (avsedd för sekvenser med hög likhet). Förutom Amel-Y från nötkreatur och får matchade de enda två relevanta (78 och 83 % homologi, E-värdena 4.10-68 och 3.10-53) träffarna ett fragment på den sjunde kromosomen hos svin (ca 250 bp), vilket tyder på att inslaget kan vara ett transposerbart element.

Vi tolkar närvaron av denna insättning som en synapomorfi (delad karaktär) hos Cetartiodactyla med undantag för grisar och troligen andra tidiga härledda grupper (kameler, flodhästar; , se fig. 3). Förutom denna långa insättning upptäcktes 46 andra indels genom sekvensanpassning (positioner och storlekar anges i figur 5). Indels är särskilt användbara för att testa fylogena hypoteser, eftersom de kan ge information om gamla divergenser snarare än populationsinformation. Vi bedömde därför om fylogenetiska topologier skiljde sig åt om vi tog hänsyn till eller inte tog hänsyn till den information som finns i dessa indels. Således analyserades valsekvenserna som sammanfattas i tabell 1 samt Artiodactyla-sekvenser först klassiskt, med luckor kodade som saknade tecken, och sedan med luckor kodade som kompletterande binära tecken (se fig. 5). För varje analys utfördes två oberoende bayesianska sökningar. De fylogenetiska träden som presenteras i figur 4 är resultatet av en konsensus av 20 000 träd som samplats efter att standardavvikelsen mellan de två körningarna sjunkit under 0,01. De visar noder med högt stöd. Den fylogenetiska analysen som utfördes på det kompletta segmentet (fig. 4a) bekräftade klusterbildningen efter könskromosomkopia i Cetartiodactyla (Stenella cœruleoalba, Balænoptera physalus, Grampus griseus, Tursiops truncatus, Bos taurus och Ovis aries), medan Amel-X och Amel-Y klustrade tillsammans i andra däggdjur (Homo sapiens, Sus scrofa) tillsammans med Amel-X från Cetartiodactyla. Å andra sidan gav fylogeni som härleddes utan att ta hänsyn till inslaget ett annat resultat (fig. 4b): medan haplotyperna också klustrades efter kromosom hos valar, kunde man inte se någon signal relaterad vare sig till arthistoria eller till kromosomlager hos de andra Cetartiodactyla. Den fylogenetiska signalen med anknytning till arthistoria tycks alltså förstärkas när vi följer trädet från Cetartiodactyla till primater. Denna partiella, homoplastiska, fortlevnad av den fylogenetiska signalen kan förklaras av inflytandet från den region som omger inlagringen. Detta kan vara ett resultat av insättningens höga ålder (74-87 myrs ). Den efterföljande förlusten av homologi kan ha gett upphov till en mer divergerande utveckling mellan kromosomerna hos vissa taxa (Cetacea) än hos andra (Artiodactyla).

Det skulle vara intressant att studera denna region på hela kladenivå genom att kombinera sekvens- och indelkaraktärer i samma analys. Detta skulle kunna ge ledtrådar för att testa de många hypoteserna om basal strålning hos Cetartiodactyla (t.ex. ). Med tanke på den förmodat basala positionen för Suioidea och Tylopoda i Cetartiodactyla-fylogenin ( och Fig. 3) antar vi att den stora evolutionära händelsen som representeras av inlagringen (illustrerad med en pil Figur 4a) inträffade en gång i kladen Cetacea-Ruminantia och inte i de återstående Cetartiodactyla.

Närvaron av denna stora insättning i Amel-Y-kopian kan vara användbar för könsbestämning.

Utvecklingshistorien tyder också på att vår teknik för könsbestämning är tillämpbar, förutom på valar, på över ett brett spektrum av Cetartiodactyla-arter, inklusive domesticerade och vilda arter, i synnerhet de utbredda Ruminantia (Bovidae, Capridae och sannolikt Cervidae). Den är dock inte lämplig för Suiformes och det krävs ytterligare studier för att bekräfta att tekniken inte heller är tillämplig på Camelidae, med tanke på deras ännu mer basala position i Cetartiodactyla-fylogenin.

Användning vid stambedömning och populationsgenetik

I delfiner kunde Amel-Y-fragmenten som amplifierades med primerparet SC1-SC2 enkelt sekvenseras utan att det krävdes kloning, eftersom amplifikationen var Y-kromosomspecifik. Av de tio prov från randiga delfiner som sekvenserades var nio hanar, och vi kunde härleda sju distinkta Y-haplotyper (en haplotyp representerad av tre individer och fyra individuella haplotyper) med 64 polymorfa platser (nukleotiddiversitet π = 0,004 ± 0,0007). Hälften av dessa fanns i inslaget på ~460 bp. En anpassning av de polymorfa platserna presenteras i figur 5 (a). Påfallande nog visade dessa sekvenser två mycket divergerande haplogrupper som skiljde sig åt med i genomsnitt 49 substitutioner. Detta stämmer överens med våra resultat som stöder den sannolika existensen av två underarter i Medelhavet (opublicerade uppgifter). Dessutom uppvisade en av dessa haplogrupper en hög grad av polymorfism, med 24 informativa platser, medan de andra endast uppvisade åtta. Dessa värden är tillräckliga för att kunna användas i stamboksanalyser och populationsgenetik, eftersom Y-kromosomens motsvarighet till den mitokondriella d-slingan hos denna art är tillräcklig. Hos den randiga delfinen är den intraspecifika divergensen (mellan grupper) faktiskt större än den interspecifika divergensen med ett genomsnitt på 45 nukleotidssubstitutioner mellan sekvenserna hos den randiga delfinen och finvalen. Det finns i genomsnitt 0,048 ± 0,01 substitutioner per plats när man jämför de två randiga delfinpopulationerna. Detta är jämförbart med den divergens som observerats mellan varje population och den vanliga delfinen (0,058 ± 0,03) och bekräftar att nukleotiddiversiteten är en storleksordning högre än det intervall som observerats (10-4) för Y-kromosommarkörer hos däggdjur . När det gäller den mitokondriella d-slingan begränsar storleken på det amplifierade fragmentet något användningen av tekniken. Vissa nedbrutna prover amplifieras inte; trots detta var ett särskilt nedbrutet spermavalsprov fortfarande amplifierbart (data visas inte).

Då Y-kromosompopulationen förväntas ha en liten effektiv storlek, är det mer sannolikt att den påverkas av genetisk drift. Den återspeglar således nyare demografiska händelser som flaskhalsar, expansioner eller grundareffekter . För att studera denna typ av händelser behöver man en markör vars mångfald är tillräckligt stor för att möjliggöra en rekonstruktion av släktträd med minsta möjliga tvetydighet och i områden där rekombination inte stör trädens unika karaktär. För detta ändamål är mycket variabla mikrosatelliter värdefulla markörer, men de kräver intensiva beräkningsmetoder för att ta hänsyn till de osäkerheter i träden som uppstår på grund av alleler som är identiska genom tillstånd och inte genom härstamning (homoplasier) . Att lägga till en ny sekvensmarkör är därför av intresse för Y-kromosompopulationsgenetik hos Cetartiodactyla. Dessutom visar den Bayesianska uppskattningen av mutationshastigheten på varje kant av båda träden i figur 4, som beräknas gemensamt med den fylogenetiska slutsatsen, höga värden för en markör av kärn-DNA: mellan 10-8 och 10-10 substitutioner per plats och per år i alla grenar av Cetartiodactyla. Detta värde ligger mellan de värden som gäller för mitokondriell d-slinga och kärn-DNA hos däggdjur.

Funktionella perspektiv i utvecklingen av amelogenin

Vi hittade två stoppkodoner vid aminosyrapositionerna 98 och 99 i exon 5 i alla Y-kromosomkopior av amelogenin hos de fyra studerade valarterna (positionerna 988-993 i sekvensen EMBL:AM744959). Amel-Y-genprodukten kan därför vara trunkerad hos dessa arter eller utgöra en pseudogen som redan observerats hos arter från de flesta andra eutheriska klasser

.