Förvärvad resistens mot aktiverat protein C, trombofili och negativa graviditetsutfall: A Study Performed in an Irish Cohort of Pregnant Women

Abstract

Kombinationen av trombofili och graviditet ökar risken för trombos och risken för negativa resultat under graviditeten. Den mest betydande vanliga ärftliga riskfaktorn för trombofili är aktiverat protein C-resistens (APCR), ett dåligt antikoagulärt svar från APC vid hemostas, som huvudsakligen orsakas av en ärftlig singelnukleotidpolymorfism (SNP), faktor V G1691A (FV Leiden) (FVL), som kallas ärftlig APCR. Förändringar i nivåerna av koagulationsfaktorer: FV, FVIII och FIX och antikoagulationsfaktorer: protein S (PS) och protein C (PC) kan förändra APC-funktionen och orsaka förvärvad APCR. Protrombin G20210A och metylentetrahydrofolatreduktas (MTHFR) C677T är protrombotiska SNP:er som i samband med APCR också kan öka risken för trombos bland kaukasier. I denna studie påvisades ett samband mellan en förvärvad APCR-fenotyp och ökade nivåer av faktorerna V, VIII och IX. Trombofila mutationer bland vår förvärvade APCR-kohort av gravida kvinnor är relativt vanliga men tycks inte utöva någon allvarlig otillbörlig negativ effekt på graviditeten.

1. Introduktion

Graviditet ökar risken för trombos. APCR-fenotypen har associerats med venös tromboembolism (VTE), den primära orsaken till mödradödlighet i utvecklade länder .

Under normala förhållanden inaktiverar APC det koagulerande proteinet aktivt FV(a) genom att i en ordnad sekvens klyva specifika platser i FV(a). Den första klyvningsstället är arginin (Arg) 506 och det andra är (Arg) 306 följt av (Arg) 679 . Mutationer i FV-genen har kopplats till APCR. FVL rapporteras hos cirka 90 % av patienterna med APCR i den allmänna befolkningen . Andra SNPs i faktor V-genen som kan bidra till ärftlig APCR antingen oberoende av varandra eller i samband med FVL-mutationen är Cambridge Arg306, Hong Kong, Arg306, Arg679 och haplotypen (H) R2- och R3-polymorfismerna. Rapporter om dessa mutationers bidrag till APCR-fenotypen är dock motstridiga .

Den patofysiologi som ligger till grund för APCR som inte orsakas av FVL-mutationen är fortfarande inte helt klarlagd. I olika studier har det föreslagits att förvärvade faktorer kan vara orsaken till APCR i avsaknad av FV Leiden . Ett antal koagulationsfaktorer kan påverka den aktiverade partiella tromboplastintiden (aPTT). Tidigare litteratur tyder på en möjlig positiv korrelation mellan nivåerna av faktorerna V, VIII och IX och förvärvad APCR . Nivåerna av protein S och protein C kan (eller kan) påverka den förvärvade APCR, men deras inflytande på resistensen verkar fortfarande ligga inom intervallet för normala nivåer .

Andra kända SNPs som är associerade med trombofili och negativa resultat under graviditeten är protrombin G20210A och MTHFR C677T .

Protrombin G20210A är förknippat med en ökning av nivån av protrombinprotein (FII) i plasma och en resulterande 3-faldig ökning av trombotiska händelser. Mutationen i protrombin G20210A tycks öka risken för trombos hos gravida kvinnor med ungefär tio gånger och risken för att utveckla obstetriska komplikationer ökar med fyra gånger .

MTHFR C677T har förknippats med obstetriska komplikationer och med fosterskador .

I en tidigare studie i detta laboratorium identifierade vi kända och nya SNP:er i ett litet antal personer med APCR som bestämts med hjälp av det modifierade Coatest-testet och som inte hade FVL-mutationen .

De huvudsakliga målen för denna studie var att (1) fastställa och jämföra nivåerna av faktorerna V, VIII och IX i de förvärvade APCR-grupperna, ärvda APCR-grupperna och APCR-negativa grupperna, (2) jämföra frekvensen av negativa utfall i APCR-positiva (förvärvade och ärvda) och APCR-negativa grupper, och (3) bestämma frekvensen av negativa graviditetsutfall, associerade med andra trombofila mutationer än FVL-mutationer i vår studiekohort (𝑛=907). De negativa graviditetsutfall som observerades i denna studie omfattade (tidigare) återkommande tidig graviditetsförlust (REPL), preeklampsi (PET) och intrauterin tillväxtbegränsning (IUGR). Graviditetsinducerad hypertoni (PIH), (IUFD) intrauterin fosterdöd och låg födelsevikt (LBW).

2. Material och metoder

2.1. Subjekt

Ett etiskt godkännande för studien erhölls från den forskningsetiska kommittén, och skriftligt samtycke till insamling av prover erhölls från de 907 gravida kvinnor som ingick i studien och som deltog i en rutinmässig öppen graviditetsscreening på antenatalkliniken vid University College Hospital, Galway, (UCHG). I tabell 1 redovisas de demografiska uppgifterna om studiepersonerna.

Blodprover (litiumheparin och EDTA) samlades in från försökspersoner mellan den 16:e och 24:e graviditetsveckan. Under denna andra trimester av graviditeten har liten eller nästan ingen variation av koagulationsfaktorerna visats, vilket är lämpligt för bedömning av APC-status . Testning av APC-status före eller från 8 till 12 veckor efter graviditeten eller oftare under graviditeten skulle ha gett ett mer exakt stabilt APC-förhållande; detta är en begränsning i den aktuella studien. Laboratorieanalysen av dåligt antikoagulanssvar på APC baseras på en analys av aktiverad partiell tromboplastintid (aPTT). En minskad kvot återspeglar den minskade inaktiveringshastigheten. Den cutoffkvot som användes för att fastställa positiv APCR i denna studie var ett värde på högst 2,1 sekunder (s). Detta värde fastställdes av hematologiavdelningen och används kliniskt vid UCHG. Det gränsvärde som används för att fastställa APCR kan variera i känslighet och specificitet beroende på metodik, utrustning och teknik som används i olika laboratorier.

2.2. APC-status med klassiskt Coatest-test för att identifiera förvärvade APCR-prover

Blodprover centrifugerades vid 4 000 rpm i 5 minuter, och alikvotar av trombocytfattig plasma frystes in vid -80 °C tills analysen ägde rum. Plasma inkuberades med en lika stor volym aPTT-reagens i 5 minuter vid 37 °C. Koagulering inleddes genom tillsats av CaCl2, och koagulationstiderna uttrycktes som kvoten mellan koagulationstiden i närvaro av APC och koagulationstiden i frånvaro av APC.

2.3. APC-status med modifierat Coatest-test för att identifiera ärftliga APCR-prover

Blodprover späddes först 1 på 5 med faktor V-deficient plasma som innehåller en heparinneutraliserare, och sedan analyserades det enligt beskrivningen för det klassiska Coatest-testet för APCR. Tillsatsen av faktor V-bristande plasma korrigerar för brister i andra koagulationsproteiner, neutraliserar terapeutiska koncentrationer av heparin och eliminerar effekten av vissa lupushämmare . APCR i närvaro av faktor V-utarmad plasma bedömdes med hjälp av Coatest APCR-kit och faktor V-utarmad plasma (Chromogenix) .

2.4. DNA-extraktion

DNA extraherades från blodprover för alla APCR-ämnen (𝑛=140) och kontrollprover (negativ APCR 𝑛=31) med hjälp av en modifiering av CF(12)m-PCR-protokollet från Ortho-Clinical Diagnostics, Amersham, Storbritannien. Spektrofotometrisk analys av absorbansen vid 260 nm utfördes i en Heλios α-spektrofotometer (Unicam Ltd., England) för varje DNA-prov, och det genomsnittliga utbytet av DNA fastställdes till 30 ng/μL.

2.5. Mutationsscreening

PCR-restriktionsenzymanalys (PCR-REA) tillämpades för att identifiera G20210A i FII-genen, C677T i MTHFR-genen och FVL-, FV Cambridge-, FV Hong Kong-mutationer och Haplotyp (H) R2-allelen i FV-genen med hjälp av modifieringar av tidigare publicerade metoder . DNA-sondhybridiseringsanalys och/eller DNA-sekvensering tillämpades för Arg679-detektion enligt beskrivningen . Etthundrafyrtio APCR-positiva personer och 31 APCR-negativa personer testades för alla mutationer. Vår grupp av kontrollpersoner som testades för trombofila mutationer, 𝑛=31, valdes slumpmässigt bland de 767 negativa APCR-personerna som identifierades som normala med APCR classic Coatest-testet. Ett medelvärde på 2,59 och en standardavvikelse på 0,2804 identifierades för denna negativa APCR-grupp av 𝑛=767 försökspersoner. Omvänt identifierades ett medelvärde på 1,745 och en standardavvikelse på 0,1104 för den positiva APCR-gruppen (nedärvd plus förvärvad) 𝑛=140. Det lägsta värdet som identifierades för negativ APCR var 2,160 medan det för positiv APCR var 1,490. Det högsta negativa APCR-värdet som identifierades var 3,030, medan det för positivt APCR var 2,060 sekunder. Trombofila mutationer stör koagulationsjämvikten genom att variera aPTT-tiden i förhållande till APCR-kvoten.

Alla mutationer undersöktes i två exemplar och positiva kontroller bestående av DNA från heterozygota och homozygota individer för FVL- och MTHFR-C677T-mutationer och heterozygota individer för andra undersökta mutationer inkluderades där det fanns tillgängligt. En negativ kontroll, bestående av vatten i stället för DNA-mall, ingick i varje PCR-körning. PCR-amplifieringen utfördes på GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, USA).

2.6. DNA-sekvensering som verifierar identifierade mutationer

DNA-sekvensering av 50 % av PCR-produkterna från försökspersoner som screenats för Arg679-mutationen utfördes för att verifiera den normala genotyp som erhållits genom Southern blot-DNA-sondhybridiseringsanalys för dessa försökspersoner. PCR-produkterna på 400 bp från exon 13 som innehåller Arg679-platsen i FV-genen renades med hjälp av QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Ltd, UK) enligt tillverkarens anvisningar och skickades för DNA-sekvensering till en extern sekvenseringstjänsteleverantör (MWG Biotech, Tyskland). Ett prov som var positivt för Cambridge-mutationen genom PCR/REA-analys renades också med QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Ltd, UK) och skickades för sekvensering för att bekräfta Arg306-mutationen.

2.7. Nivåer av faktorerna V, VIII och IX

Nivåerna bestämdes för de APCR-positiva och APCR-negativa grupperna med hjälp av en enstegs APTT-analys på en MDA 180-koagulometer (Organon Teknika, Cambridge, Storbritannien), med hjälp av plasma med brist på faktorerna V, VIII och IX (Diagnostica Stago). Den APCR-negativa gruppen bestod av 50 kvinnor som valdes slumpmässigt från olika batchkörningar av Coatest-tester som utgjorde grunden för kontrollgruppen vid jämförelse av data mellan olika variabler.

Resultaten för faktor V-, VIII- och IX-nivåerna uttrycktes som procentuella (%) nivåer, och de referensintervall som användes är för närvarande i klinisk användning vid hematologilaboratoriet, UCHG. Varje körning kontrollerades genom användning av en normal (MDA verify 1, Biomerieux) och en onormal kontroll (koagulationskontroll A, Technoclone GmbH).

2.8. Statistisk analys av oönskade graviditetsutfall i den grupp som observerades hos de 907 kvinnor som ingick i studien

Data samlades in från mödravårdsavdelningen vid UCHG. Antalet och typen av undersökta graviditetsutfall analyserades med hjälp av programvaran SPSS version 17.0. Pearsons Chi Square-test användes för att jämföra den APCR-positiva gruppen och den negativa APCR-gruppen för att analysera de trombofila mutationerna och utbudet av negativa utfall förknippade med varje grupp. Pearsons Chi-Square-test användes för att jämföra antalet och typen av negativa graviditetsutfall i den ärftliga respektive förvärvade APCR-gruppen. SPSS användes för att analysera nivåerna av koagulationsfaktorerna V, VIII och IX med hjälp av det statistiska testet Kruskal-Wallis.

2,9. Kriterier för negativa resultat Diagnos

PET-BP (blodtryck) ≥140/90 mmHg, +1 proteinuri och ödem. PIH-BP ≥140/90 utan proteinuri i enlighet med Official Journal of the International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy. IUGR definieras som en fostertillväxt som är mindre än 5:e percentilen för gestationsåldern . LBW definieras som en vikt på mindre än 2500 g (upp till och med 2499 g), oavsett gestationsålder.

3. Resultat

Vi identifierade 15,4 % (𝑛=140) av studiekohorten (𝑛=907) som APCR-positiva med förvärvade och/eller ärvda Coatest-test. Nivåerna av faktorerna V, VIII och IX visade en positiv korrelation med en förvärvad APCR-fenotyp. Nivåerna för varje faktor i APCR-positiva (ärvda) och APCR-positiva (förvärvade) och APCR-negativa grupper visas i tabell 2 och figur 1. Nivåerna av faktorerna V, VIII och IX i den förvärvade APCR-gruppen var signifikant högre jämfört med den normala kontrollgruppen. Medelvärdena var faktor V 131,5 IU/dL jämfört med 114,6 IU/dL för kontrollgruppen, faktor VIII 128,7 IU/dL jämfört med 111,9 IU/dL för kontrollgruppen och faktor IX 114,8 IU/dL jämfört med 106,9 IU/dL för kontrollgruppen.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figur 1

(a) Diagram där FV-nivåerna jämförs i olika grupper inom studien, (b) Graf som jämför FVIII-nivåer i olika grupper inom studien, och (c) Graf som jämför F IX-nivåer i olika grupper inom studien.

Nyckeltvå personer (66 %) i den positiva APCR-gruppen hade vanliga trombofila mutationer, varav 32 % hade FVL-mutationen. Totalt 𝑛=116 mutationer identifierades i denna grupp, 68 försökspersoner hade en mutation, 23 hade två mutationer, 1 försöksperson hade tre mutationer och fyrtioåtta försökspersoner hade ingen av de kända mutationerna som screenats för.

I den förvärvade (utan FVL) positiva APCR (𝑛=105) fördelades 70 mutationer på 61 försökspersoner som hade en eller flera av dessa mutationer. Inom den negativa APCR-gruppen (𝑛=31) hade 18 försökspersoner en mutation. Fördelningen av trombofila mutationer sammanfattas i tabell 3.

APC Mutationer som identifierats/subjekt som testats Frekvens från delmängden testade subgrupper av subjekt i varje grupp (*1) (*2), (*3). Frekvens från den totala kohorten 𝑛=907 Thrombofila mutationer identifierade (*1) 𝑛=140 Positiv APCR (nedärvd och förvärvad) 67/140 47.8% 7,3% MTHFR-C677T (54ht13hom) 3 /140 2.1% 0,3% ht protrombin G20210A 16/140 11,4% 1.7% ht (H) R2 29/140 20,7% 3,1% ht FV Leiden 1/140 0.7% 0,1% ht Cambridge 48/140 31,4% 3.9% ingen mutation (*2) 𝑛=105 Positiv APCR (förvärvad) 51/105 48.5% 5.6% MTHFR -C677T (38ht13hom) 3/105 2,8% 0,3% ht Prothrombin G20210A 16/105 15.2% 1,7% ht(H) R2 44/105 41,9% 4.8% ingen mutationer (*3) 𝑛=31 Negativ APCR 5/31 16.1% 0,6% ht (H) R2 13/31 41,9% 1.7% MTHFR-C677T 13/31 41.9% 1.7% Ingen mutation

(*1) 𝑛=140 är försökspersoner med total APCR (förvärvad +modifierad). (*2) 𝑛=105 är försökspersoner med förvärvad APCR, utan ärvd FVL. (*3) 𝑛=31 är negativa APCR-ämnen som testats av 767. 𝑛: Antal försökspersoner; ht: Heterozygoter; hom: Homozygoter; H: Haplotyp. Föremål som identifierats med mer än en mutation samtidigt: I den totala APCR-gruppen (nedärvda plus förvärvade) fanns det 13 personer med MTHFR+FVL, 1 person med MTHFR + FVL + Cambridge, 7 personer med MTHFR + HR2, 1 person med protrombin G20210A + HR2; och 1 försöksperson med protrombin G20210A + MTHFR; i den förvärvade APCR-gruppen fanns 7 försökspersoner med MTHFR+HR2; 1 försöksperson med protrombin G20210A + HR2; 1 försöksperson med protrombin G20210A + MTHFR.

Tabell 3

Fördelning av de trombofila mutationer som identifierats i vår studiekohort.

Frekvenserna av negativa utfall i de positiva APCR-grupperna och de negativa APCR-grupperna var mycket likartade, 35,7 % respektive 34,2 % (tabell 4). Jämförelsen mellan negativa graviditetsutfall och trombofila mutationer sammanfattas i tabell 5. PIH visade ett statistiskt signifikant (𝑃<0,05) samband med Cambridge och protrombin G20210A. LBW visade ett statistiskt signifikant (𝑃<0,05) samband med HR2 och MTHFR.

Totala resultat frekvens EPL PET PIH IUGR IUFD LBW Positivt 𝑁=140 𝑁=50 𝑁=38 𝑁=3 𝑁=12 𝑁=1 𝑁=0 𝑁=37 APCR Freq.% 35.7% 27.1 % 2.2% 8.6% 0.7% 0% 26.8% Negativ 𝑁=767 𝑁=262 𝑁=196 𝑁=39 𝑁=37 𝑁=20 𝑁=3 𝑁=256 APCR Freq.% 34.2% 25.7% 5.2% 4.9% 2.6% 0.4% 34.5% Pearson Chi-Square 𝑃 värde 0.722 0.712 0.125 0.077 0.168 0.456 0.080

Tabell 4

Frekvens av negativa utfall som identifierats i positiva APCR (förvärvade plus ärvda) jämfört med negativa APCR. 𝑃 värde från Pearson Chi-Square-test tillämpat på positiv APCR (förvärvad plus ärvd) jämfört med negativ APCR.

4. Diskussion

Frekvensen APCR har rapporterats vara cirka 5 % i den allmänna kaukasiska befolkningen . Detta varierar från 1 % till 15 % i olika länder med en frekvens på 3 % rapporterad i Italien och Spanien och en frekvens på 15 % rapporterad i norra Sverige . APCR i den allmänna befolkningen och under graviditet rapporteras oftast orsakas av FVL-mutation , ärftlig APCR .

Enskilda rapporter har dock visat att mellan 5 och 10 % av APCR hos kaukasier inte involverar FVL, och orsaken till positiv APCR i dessa fall är inte känd . I vår studiekohort (𝑛=907) var frekvensen av förvärvad APCR, fastställd med den klassiska Coatest-testmetoden, på 11,5 %, betydligt högre än frekvensen av ärftlig APCR identifierad med modifierade Coatest-test, 3,9 %. De Visser et al. visade att en förändrad APCR i avsaknad av FVL medför en 2,5-faldigt ökad risk för venös trombos .

I denna studie påvisades en signifikant statistisk korrelation mellan den förvärvade APCR-fenotypen och nivåerna av faktorerna V, VIII och IX. Ytterligare studier skulle krävas för att bestämma interaktionen mellan koagulationsfaktorer för att ytterligare karakterisera denna förvärvade APCR-fenotyp i tidig graviditet. Förvärvad APCR kan vara resultatet av en komplex serie reaktioner som ger en defekt APC-medierad nedbrytning av dessa koagulationsfaktorer. I sin tur kan en ökning av dessa koagulationsfaktorer i tidiga graviditetsstadier orsaka en obalans i koagulationskaskaden och leda till kärl- och endotelskador under implantation och placentering. Detta har potential att orsaka placentainfarkter och höga nivåer av fibrinavlagring, vilket tidigare har förknippats med APCR . Spontan abort kan ske som svar på en ökad koagulationsobalans, och om det finns andra trombotiska faktorer, inklusive trombofila mutationer, som interagerar samtidigt när ämnet är bortom den 20:e graviditetsveckan, kan skadan utvecklas till PET eller PIH.

Mutationer i FV-genen, med undantag av FVL, särskilt vid de andra klyvningsställena för FV, Arg306 och Arg679, har potential att bidra till APCR-fenotypen . Haplotyp (H) R2 har också associerats med mild APCR när den finns i kombination med FVL . Ett antal andra mutationer har identifierats i FV-gen, men en större gravid population måste studeras för att avgöra om dessa mutationer bidrar väsentligt till APCR i de kaukasiska populationerna . Trombofili under graviditet har kopplats till andra mutationer än de som finns i FV-genen, bland annat protrombin G20210A och MTHFR-C677T . I den här studien identifierade vi trombofila mutationer i 66 % av vår positiva APCR-grupp (förvärvad plus ärvd) (𝑛=140). En av dessa personer hade 2 mutationer i FV-genen, FVL och FV Cambridge-G1091C, vid två klyvningsställen av FV för APC . Denna person konstaterades också i denna studie vara bärare av MTHFR-C677T-mutationen. Tidigare studier har visat att förekomsten av mer än en protrombotisk polymorfism är förknippad med en betydande risk för VTE med en hög risk för negativa graviditetsutfall . På senare tid har MTHFR-C677T-mutationen dessutom kopplats till preeklampsi. Den höga frekvensen av MTHFR-C677T i de negativa APCR- och positiva APCR-grupperna kan ligga bakom befolkningsspecifika skillnader . Skillnader i de negativa graviditetsutfall som är förknippade med MTHFR-C677T kan förklaras av de specifika frekvensskillnaderna mellan olika populationer .

Vi identifierade också protrombin G20210A hos 3 försökspersoner i den förvärvade APCR-gruppen utan förekomst av FVL-mutation, med haplotypen (H) HR2 och MTHFR-C677T identifierade i både positiva APCR-grupper (förvärvade plus ärvda) och negativa APCR-grupper.

De negativa APCR-proverna (𝑛=31) som testades för trombofila mutationer i denna studie för att representera den normala kohorten är ett litet antal prover, och detta kan vara en brist i vår studie som resulterar i icke-signifikanta skillnader. Att testa ett större antal negativa APCR skulle ha gett säkrare resultat. Detta kan vara något som bör undersökas i en framtida studie.

Men vissa tidigare studier har visat ett samband mellan positiv APCR och PET, IUGR och IUFD i denna studie fanns det ingen signifikant skillnad i frekvensen av negativa resultat mellan positiva APCR- och negativa APCR-grupper. Detta verkar stämma överens med andra tidigare studier . Trots detta gör den totala frekvensen av negativa graviditetsutfall i den positiva APCR-gruppen denna undersökningsgrupp till ”en högriskgrupp”. Miljöfaktorer som rökning och kroppsmasseindex (BMI), som skulle kunna ha påverkat andelen förvärvade APCR och frekvensen av identifierade negativa utfall, ingick inte. Detta är en begränsning av studien.

I vår totala undersökningsgrupp verkar trombofila mutationer inklusive FVL Cambridge och Prothrombin G20210A vara relaterade till PIH, medan MTHFR-C677T och HR2 haplotyp verkade vara associerade med LBW. Även om positiv APCR i sig inte verkar vara orsaken till allvarliga negativa utfall under graviditeten, kan ärftlig APCR ändå ha en effekt på hypertoni när den förekommer i kombination med andra kända och okända trombofila riskfaktorer som verkar samtidigt under graviditeten.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Irish Health Research Board. Författarna vill tacksamt tacka de gravida kvinnor som samtyckte till att delta i studien och barnmorskorna från förlossningsavdelningen vid UCHG. Författarna vill tacka Benoit Houeix för hans bidrag till den statistiska analysen som ingår i detta dokument och även dr D. Mongan, UCH, Galway, för hennes samarbete när det gäller att tillhandahålla information om negativa resultat och dataanalys av de personer som ingick i studien.