Ingen uppreglering av CAP1, men förhöjd fosforylering av S308/S310, upptäcktes i pankreascancerceller
CAP1-proteinnivåer bestämdes i Western Blotting i en panel av vanligt förekommande pankreascancercellinjer {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 och Mia PaCa-229}, och jämfördes med den i den odödliga men otransformerade pankreascellinjen hTERT-HPNE30, som fungerar som kontroll. Som framgår av figur 1A uttrycker alla fyra cancercellinjer rikliga nivåer av CAP1 som är jämförbar med den i HeLa-celler, som vi tidigare rapporterat att de uttrycker rikliga nivåer av både CAP1 och CAP212. Vi fann att de otransformerade hTERT-HPNE-cellerna uttryckte jämförbara nivåer av CAP1 med dem i cancercelllinjerna. Vi undersökte också uttrycksnivåerna för den andra CAP-isoformen, CAP2, och fann att PANC-1- och Mia PaCa-2-cellerna hade ett avsevärt uppreglerat CAP2-uttryck jämfört med det i hTERT-HPNE-cellerna (fig. 1A).
Elevad S308/S310-fosforylering på CAP1, men inte uppreglerat CAP1-uttryck, upptäcktes i cancerceller från bukspottkörteln. (A) Western blot avslöjar rikliga uttrycksnivåer av CAP1 som är jämförbara med dem i HeLa-cellerna upptäcktes i alla fyra cancercellinjerna, och kontrollcellerna i bukspottkörteln (hTERT-HPNE) har en liknande CAP1-uttrycksnivå. CAP2-blotresultaten visar att cancercellerna PANC-1 och Mia PaCa-2 uttrycker rikliga CAP2-nivåer som var anmärkningsvärt högre än i kontrollcellerna hTERT-HPNE. (B) Western blot visar förhöjd S308/S310-fosforylering på CAP1 i PANC-1- och CFPAC-1-pankreascancercellerna jämfört med de otransformerade hTERT-HPNE-pankreascellerna. Den fosforspecifika antikroppen känner igen fosforsignaler på båda resterna. De anpassade sekvenserna högst upp visar de sekvenser som omger tandemfosforregleringsplatsen. Serinresterna (S307 & S309 på mus CAP1; S308 & S310 på human CAP1) i tandemplatsen är markerade i fet och kursiv form (även understrukna). Fosfor-signalerna kvantifierades med hjälp av densitometri, och resultaten från tre experiment analyserades med Students t-test och plottades i grafen där felstaplarna representerar S.E.M. ”*” indikerar P < 0,05 och ”**” indikerar P < 0,01. (C) Behandling av celler med GSK3-hämmaren 6-BIO i 16 timmar minskade anmärkningsvärt CAP1-fosforyleringen i både PANC-1 bukspottkörtelcancerceller och hTERT-HPNE-cellerna, på ett dosberoende sätt. 6-BIO minskade också CAP1-fosforyleringen i CFPAC-1-celler på liknande sätt (ej visat). GAPDH tjänar som lastningskontroll i Western blotting.
Vi har tidigare rapporterat att GSK3 fosforylerar S309 på CAP124 från musen (motsvarande S310 på CAP1 från människan; anpassade sekvenser visas i fig. 1B). Med tanke på den rapporterade hyperaktiveringen av GSK3 i bukspottkörtelcancer25 undersökte vi en potentiell förhöjning av S308/S310-fosforylering på CAP1 i cancerceller, med hjälp av en fosforspecifik antikropp som känner igen fosforsignaler på båda serinresterna i Western blotting24. Intressant nog var S308/310-fosforyleringen signifikant förhöjd i cancercellerna jämfört med kontrollcellerna (Fig. 1B, visas med kvantifierade data endast för cellinjerna PANC-1 och CFPAC-1, men liknande resultat erhölls med AsPC-1 och Mia PaCa-2-celler). Därefter inhiberade vi GSK3 genom att behandla cancerceller med en potent GSK3-hämmare 6-BIO (6-bromoindirubin-3′-oxim)31 och fann att behandlingen minskade S308/S310-fosforyleringen på CAP1 i PANC-1- och CFPAC-1-cellerna, på ett dosberoende sätt (Fig. 1C, visas endast för PANC-1-celler). Behandling med 6-BIO minskade också CAP1-fosforyleringen i kontrollpankreascellerna. Konsekvent minskade en mer selektiv GSK3-hämmare, LiCl32, också CAP1-fosforyleringen i PANC-1- och AsPC-1-celler, vilket visas senare. Dessa resultat stöder att GSK3 också är en del av fosforyleringsmaskineriet för CAP1 vid S308/S310 i pankreascancerceller. Det noteras också att behandling av cancerceller och kontrollceller med 6-BIO konsekvent ledde till märkbar uppreglering av CAP1, genom en okänd mekanism.
Knockdown av CAP1 ledde till ökade stressfibrer samt minskad motilitet och invasion av cancerceller
Nästan försökte vi tysta CAP1 för att fastställa CAP1:s roller i pankreascancerceller. Det stabila knockdown-paradigmet som vi tidigare utvecklat är kompatibelt med en räddningsstrategi, vilket gör det möjligt att verifiera specificiteten hos härledda fenotyper från utarmning av CAP112,18,24. Med hjälp av två shRNA-konstruktioner S2 och S3 som riktar sig mot oberoende nukleotidsekvenser och effektivt tystade CAP1 i HeLa- och bröstcancerceller12,18,24,33, kunde vi generera stabila kloner med effektiv knockdown av CAP1 i PANC-1- och AsPC-1-cellerna, vilket bekräftades i Western Blotting (fig. 2A). Två stabila knockdown-kloner vardera som härrörde från PANC-1 (S2-1 och S3-3) och AsPC-1 (S2-3 och S2-7), etablerades respektive genom selektion med neomycin. Försök att tysta CAP1 i cancercelllinjerna CFPAC-1 och Mia PaCa-2 misslyckades dock. CFPAC-1-cellerna misslyckades med att bilda kolonier efter antibiotikaselektion, medan ingen av de cirka två dussin stabila kolonier som undersöktes hade en väsentlig minskning av CAP1-uttrycket i Mia PaCa-2-cellerna (data visas inte).
Nedsläckning av CAP1 i cancerceller ledde till förbättrade aktinstressfibrer och minskad cellmotilitet och invasion. (A) Effektiv knockdown av CAP1 i två stabila kloner vardera för både PANC-1- och AsPC-1-celler, vilket bekräftades i Western Blotting. CAP1 detekterades i Western blotting, där GAPDH användes som laddningskontroll. (B) Utarmning av CAP1 i PANC-1-celler ledde till ökade aktinstressfibrer. I kontrollceller som hyser den tomma vektorn för shRNA (Vec) fanns det mycket begränsade aktinstressfibrer (indikerat med pilar). I CAP1-knockdown-cellerna (S2-1 och S3-3) var däremot aktinstressfibrerna förstärkta (markerade med pilar), vilket observerades i fluorescensmikroskopi efter Phalloidinfärgning. (C) Depletion av CAP1 minskade motiliteten i både PANC-1- och AsPC-1-celler som detekterades i sårläkning och Transwell-migrationsanalyser (endast för PANC-1). För Transwell-migrationsanalyser laddades ~2 × 104 celler serumstarkade över natten på varje insats som placerades i en brunn fylld med medium innehållande serum. Efter 16 timmar noterades migrerade celler och data från tre oberoende experiment samlades in, analyserades med hjälp av Students t-test och plottades i diagrammet där felstaplarna representerar S.E.M. ”*” indikerar P < 0,05 jämfört med kontrollcellerna som bär en tom vektor (Vec). (D) Utarmning av CAP1 minskade Matrigelinvasionen i PANC-1-celler. Försöken samt datainsamling och analyser utfördes på samma sätt som i Transwell-migrationsförsöken, förutom att insättningsmembranen var förbelagda med Matrigel. ”*” anger P < 0,05 jämfört med kontrollcellerna. (E) Minskad EMT i CAP1-knockdown PANC-1-cellerna, vilket indikeras av ökat E-Cadherin-uttryck samt minskade Vimentin-uttrycksnivåer i de stabila CAP1-knockdown-klonerna. GAPDH fungerar som lastningskontroll i Western blots.
Vi undersökte först morfologiska och aktincytoskeletala förändringar i CAP1-knockdown PANC-1- och AsPC-1-cellerna. Till skillnad från den ökade cellstorleken i CAP1-knockdown HeLa och metastatiska bröstcancerceller12,18,24 orsakade depletion av CAP1 ingen märkbar ökning av storleken på PANC-1- eller AsPC-1-cellerna. Därefter färgade vi aktincytoskelettet i PANC-1-cellerna med Phalloidin, följt av fluorescensmikroskopi. PANC-1-celler (och pankreascancerceller i allmänhet) verkar ha dåligt organiserade aktincytoskelettstrukturer, särskilt när det gäller stressfibrerna (fig. 2B), i förhållande till de cellinjer som vanligen används för studier av aktincytoskelettet, såsom HeLa och NIH3T3-fibroblaster12,24. Icke desto mindre var ökade stressfibrer uppenbara i de CAP1-knockdown PANC-1-cellerna jämfört med kontrollcellerna (fig. 2B). Alla 26 kontrollceller som hyser en tom vektor som undersöktes visade mycket begränsad förekomst av stressfibrer. Däremot hade 20 av 27 (74,1 %) av S2-1 och 18 av 23 (78,3 %) av S3-3 CAP1-knockdown-celler som undersöktes anmärkningsvärt förstärkta stressfibrer, vilket liknar det som visas i fig. 2B. Ackumulering av stressfibrer har konsekvent observerats i andra celler med CAP1-depletion12,13, en fenotyp som tros härröra från förlusten av båda CAP1-funktionerna för att sequestrera aktinmonomerer och för att främja omsättningen av aktinfilamenten.
Sammanhängande med de förstärkta stressfibrerna har depletion av CAP1 rapporterats minska motiliteten i ett antal däggdjurscelltyper, inklusive cancerceller13,14,17,18,19. Transient knockdown av CAP1 i cancerceller från bukspottskörteln visade sig också minska cellmotiliteten i sårläkningsförsök14. Vi testade effekten av stabil knockdown av CAP1 på pankreascancercellernas invasivitet genom att utföra sårläkningsanalyser, Transwell-migrationsanalyser och Matrigel-invasionsanalyser. Utarmning av CAP1 minskade väsentligt cellmotiliteten i sårläkningsanalyserna för både PANC-1- och AsPC-1-celler (fig. 2C), vilket stämmer överens med de tidigare rapporterade resultaten14. Såren i CAP1-knockdown PANC-1-cellerna (både S3-3 och S2-1) läkte endast marginellt 24 timmar efter införandet, medan gapet i kontrollcellerna hade fyllts nästan helt. Liknande effekter observerades i de stabila CAP1-knockdown AsPC-1-klonerna S2-3 och S2-7 (fig. 2C). Resultaten från Transwell-migrationsanalyserna av PANC-1-celler överensstämde med resultaten från sårläkningsanalyserna, vilket framgår av grafen med kvantifierade resultat i den nedre panelen (fig. 2C). Dessutom visar invasionsanalyserna att utarmning av CAP1 också minskade PANC-1-cancercellernas förmåga att penetrera och invadera genom Matrigel (fig. 2D). Studenternas t-testanalyser av data som samlats in från tre oberoende tester avslöjar en signifikant minskad invasion i de stabila PANC-1-cellerna med CAP1-knockdown (fig. 2D). Slutligen, eftersom EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) är relaterat till cancercellers invasivitet, testade vi den potentiella effekten av CAP1 knockdown på EMT. De CAP1-nedslagna PANC-1-cellerna hade faktiskt uppreglerat E-Cadherin, vilket tyder på minskad EMT (fig. 2E). Vi testade också en annan EMT-markör, Vimentin, och fann att utarmning av CAP1 minskade dess uttryck (Fig. 2E). Tillsammans stöder dessa resultat en nödvändig roll för CAP1 i invasivitet och EMT i PANC-1 cancercellerna.
Hämning av GSK3, som undertrycker CAP1-fosforylering, minskade motilitet och invasion av cancerceller
Våra tidigare fynd tyder på att övergående fosforylering är avgörande för CAP1-funktionen när det gäller reglering av aktincytoskelettet24. Den förhöjda CAP1-fosforyleringen i cancerceller i bukspottkörteln, som överensstämmer med den aktiverade GSK3, tyder på att fosforreglering också kan spela en roll för CAP1-funktionen i cancercellers invasivitet. Vi testade denna möjlighet genom att hämma GSK3, som undertrycker S308/S310-fosforylering och samtidigt stör CAP1-regleringen genom övergående fosforylering vid den reglerande platsen. PANC-1-celler behandlades med 6-BIO följt av cellmigrations- och invasionsanalyser. Effekter av den minskade S308/S310-fosforyleringen på CAP1, genom behandling med 5 μM 6-BIO (fig. 1C), testades först. Som visas i figur 3A minskade 6-BIO-behandlingen signifikant motiliteten hos PANC-1-celler i både sårläkning och Transwell-migrationsanalyser. Vi bekräftade också att behandling av PANC-1- och AsPC-1-celler med en annan GSK3-hämmare, LiCl, minskade CAP1-fosforylering samt cellmotilitet i sårläkningsanalyser (fig. 3A,B). Dessutom minskade 6-BIO-behandlingen också Matrigelinvasionen av PANC-1-celler (fig. 3C). Slutligen, eftersom GSK3 är känt för att reglera ett brett spektrum av cellfunktioner genom en mängd substratmolekyler, är effekten av GSK3-hämning på cellmotilitet sannolikt ett kollektivt resultat genom flera GSK3-måltavlor som är involverade i regleringen av cytoskelettet, cellpolarisering och migration34,35. Vi testade och jämförde därför effekterna av 6-BIO när det gäller att minska cellmotiliteten i CAP1-knockdown PANC-1-celler och kontrollceller. Som framgår av diagrammet i fig. 3D minskade 6-BIO-behandlingen signifikant motiliteten hos kontrollcellerna (Vec) men inte hos CAP1-knockdown-cellerna (S2-1 och S3-3) i sårläkningsförsöken. Sammantaget stöder dessa resultat att fosforreglering genom S308/S310 spelar en viktig roll för CAP1 för att främja motilitet och invasion i pankreascancerceller.
Hämning av GSK3, som minskade CAP1-fosforylering, äventyrade också cancercellers motilitet och invasion. (A) Behandling av PANC-1-celler med 6-BIO eller LiCl minskade cellmotiliteten vid sårläkning och Transwell-migrationsanalyser. Behandling med 100 mM LiCl minskade effektivt CAP1-fosforylering även i PANC-1-celler. Transwell-migrationsanalyser med PANC-1-celler utfördes på samma sätt som beskrivs i figur 2 där NT anger celler utan 6-BIO-behandling. (B) Behandling med 100 mM LiCl minskade också märkbart CAP1-fosforylering i AsPC-1-celler, liksom cellmotilitet i sårläkningsanalyser. (C) Behandling av PANC-1-celler med 5 μM 6-BIO minskade signifikant cancercellsinvasionen i Matrigel invasionsanalyser. Matrigelinvasionsanalyser, inklusive datainsamling och analyser, utfördes på liknande sätt som beskrivs i fig. 2D. (D) Knockdown av CAP1 i PANC-1-celler äventyrade effekten av 6-BIO när det gäller att minska cellmotiliteten i sårläkningsanalyser. Kontroll- och CAP1-knockdown-stabila PANC-1-kloner odlades i 16 timmar efter införandet av såret, och de streckade linjerna anger kanterna på den initiala luckan. Cellmotiliteten kvantifierades, analyserades med hjälp av Students t-test och plottades i grafen där felstaplarna representerar standardavvikelsen. ”*” anger P < 0,05 och ”**” anger P < 0,01.
Fosformutanter av CAP1 hade komprometterade funktioner för att lindra de förstärkta stressfibrerna och främja utvecklingen av lamellipodier i CAP1-knockdown PANC-1-cellerna
Våra resultat från CAP1-knockdown-cellerna stödjer att CAP1 krävs för cancercellers motilitet och invasion, och resultaten från GSK3-hämning tyder på att S308/S310-fosforylering spelar en nyckelroll i CAP1-funktionerna. Därefter använde vi en strategi för återexpression för att ytterligare fastställa dessa fall. Vild typ CAP1 (WTCAP1) och fosformutanter som efterliknar antingen fosforylerade (S307D/S309D; DD) eller icke-fosforylerbara (S307A/S309A; AA) former av CAP1, som tidigare beskrivits12,18,24, återexpresterades stabilt i PANC-1-cellerna med CAP1-nedsläckta celler för att testa deras förmåga att rädda aktincytoskeletala och cellmorfologiska fenotyper. Dessa mutanter har missmatchningar mot S3 shRNA-målsekvensen för att undvika att de härledda mRNA:erna känns igen av det shRNA som är stabilt närvarande i de nedsläckta cellerna, men utan att ändra någon aminosyra på CAP112. Vi kunde etablera stabila kloner som återuttrycker WT mus CAP1, eller fosformutanten AA och DD, vilket bekräftades i Western Blotting mot 6xHis taggen (Fig. 4A). Observera att två irrelevanta körfält hade tagits bort från den ursprungliga Western blot-bilden (prover i dessa två körfält användes för att bekräfta återuttryck av två serin 36 fosformutanter vid N-terminalen). Hela uppsättningen av det ursprungliga Western blot-resultatet visas i kompletterande figur 1. Morfologin hos celler som återuttrycker antingen AA (AA-R) eller DD (DD-R) mutanten undersöktes i fasmikroskopi och jämfördes med morfologin hos celler som återuttrycker WTCAP1 (WT-R). Det har rapporterats att knockdown av CAP1 i vissa däggdjurscelltyper, inklusive HeLa och metastatiska bröstcancerceller, ledde till signifikant ökad cellstorlek12,13,18, en fenotyp som vi tidigare har bekräftat är specifik för knockdown av CAP112,18. CAP1-knockdown i PANC-1-celler eller AsPC-1-celler visade dock inte den effekten. Snarare var det så att stabil återexpression av WTCAP1 eller fosformutanterna i knockdown-cellerna faktiskt ökade cellstorleken betydligt (fig. 4B). Dessutom ledde återexpression av WTCAP1 till utveckling av lamellipodier av robust storlek (markerade med pilar), en subcellulär struktur som är rik på filamentöst aktin och som är kritisk för att driva riktningsbestämd cellrörelse (fig. 4C), medan praktiskt taget ingen av de knockdown-celler som hade en tom kontrollvektor utvecklade några sådana lamellipodier. Återuttryckt AA- eller DD-mutant stimulerade också bildandet av lamellipodier i viss utsträckning, men deras storlek var märkbart mindre jämfört med den i cellerna som återuttryckte WTCAP1 (indikerat med pilar i fig. 4C). Vi räknade 200 celler för varje celltyp, och procentandelarna celler som hyser lamellipodier av stor storlek var: 0 % (0/200) för knockdown-cellerna (Vec), 14,5 % (29/200) för WT-R-cellerna och 9 % (18/200) respektive 7,5 % (15/200) för AA-R- och DD-R-cellerna.
Effekter av återexpression av WTCAP1 och fosformutanterna i CAP1-knockdown PANC-1-cellerna på aktincytoskelettet, cellstorlek och lamellipodiutveckling. (A) Bekräftelse av återexpression av WTCAP1 och fosformutanterna AA och DD i de stabila S3-3 CAP1-knockdown PANC-1-cellerna i Western Blotting med hjälp av antikroppen mot 6xHis-tagget. Två irrelevanta körfält hade tagits bort från den ursprungliga Western blot-bilden (visas i kompletterande figur 1). (B) Kvantifierade data som visar signifikant ökad cellstorlek i celler som återuttrycker WTCAP1 eller fosformutanterna i CAP1-knockdown-cellerna. Storleken på 50 celler per fält mättes med hjälp av programmet Image-J. Data analyserades med hjälp av Students t-test och plottades i grafen där felstaplarna anger standardavvikelsen. ”*” anger P < 0,05 jämfört med kontrollcellerna som bär den tomma vektorn (Vec-R). (C) Fasbilder visar att återexpression av WTCAP1 eller fosformutanterna stimulerade bildandet av lamellipodier. Några av de celler som återuttrycker WTCAP1 (WT-R) utvecklade extremt stora lamellipodier (markerade med pilar). Återexpression av AA- (AA-R) eller DD-mutanten (DD-R) simulerade också bildandet av lamellipodier, men deras storlekar är märkbart mindre jämfört med dem i de celler som återexpresterade WTCAP1. Inga sådana lamellipodier observerades i kontrollcellerna med CAP1-knockdown som hade den tomma vektorn (Vec-R). (D) Återexpression av WTCAP1 i CAP1-knockdown PANC-1-cellerna minskade stressfibrerna, medan cellerna som återexpresterade mutanterna hade ökade stressfibrer. Cellerna som återuttryckte den fosformimetiska DD-mutanten hade de mest förstärkta stressfibrerna. Pilarna visar stressfibrerna, eller avsaknaden av sådana i fallet med WT-R-cellerna.
Nästan tittade vi på fosformutanternas förmåga att lindra de förstärkta stressfibrerna i de CAP1-knockdown PANC-1-cellerna. Som framgår av de konfokala bilderna i figur 4D lindrade återexpression av WTCAP1 (WT-R) effektivt de förstärkta stressfibrerna och räddade därmed fenotypen, och stressfibrerna upplöstes i stora områden som anges med en pil. Däremot var fosformutanterna mindre effektiva när det gäller att lindra de förstärkta stressfibrerna. Celler som återuttrycker AA-mutanten hade blygsamt förstärkta stressfibrer än de celler som räddades av WTCAP1, medan de celler som återuttrycker DD-mutanten tycktes ha ännu mer förstärkta stressfibrer. Dessa resultat överensstämmer med våra tidigare resultat från HeLa-celler som tyder på att avfosforylerad CAP1 är den ”aktiva” formen i förhållande till fosforylerad CAP124, medan övergående fosforylering tros krävas för optimala cellulära funktioner hos CAP1. Dessa resultat tyder också på att transient S308/S310-fosforylering är viktig för att CAP1 ska kunna reglera aktincytoskelettet i cancerceller i bukspottkörteln; störning av regleringen genom transient fosforylering leder till defekter i CAP1:s funktion när det gäller att främja omsättningen av aktinfilamenten.
CAP1 fosformutanter hade defekter som räddade den minskade invasiviteten i CAP1-knockdown cancerceller
Då dynamisk aktinfilamentomsättning är den primära drivkraften för cellrörelse testade vi nästa gång hur väl fosformutanterna räddar den minskade cellmotiliteten och invasionen i CAP1-knockdown PANC-1-celler. Vi utförde först Transwell-migrationsanalyser och fann att återexpression av WTCAP1 signifikant ökade cellmotiliteten jämfört med kontrollcellerna som hyser en tom vektor, vilket visas i kvantifierade resultat i grafen (Fig. 5A). Den återexprimerade AA-mutanten (AA-R), även om den inte var lika effektiv som WTCAP1, räddade delvis den minskade cellmotiliteten i Transwell-migrationsanalyserna. Däremot lyckades DD-mutanten (DD-R) inte rädda den minskade cellmotiliteten, och hastigheten var jämförbar med den i CAP1-knockdown-cellerna som bär en tom vektor. Dessa resultat stämmer överens med förmågorna att rädda de förstärkta stressfibrerna genom WTCAP1 och fosformutanterna. Vi testade vidare räddning av den minskade Matrigelinvasionen i CAP1-knockdown-cellerna, vilket visas i de kvantifierade resultaten i fig. 5B. På samma sätt räddade WTCAP1 den minskade invasionen i de CAP1-knockdown PANC-1-cellerna mest effektivt; AA-mutanten uppnådde en partiell räddning medan DD-mutanten bokstavligen misslyckades med att rädda fenotypen. Slutligen minskade återexpression av WTCAP1 i CAP1-knockdown-cellerna också E-Cadherin-uttrycket (fig. 5C), vilket ytterligare stöder att CAP1 krävs för EMT i PANC-1-cancerceller. Tillsammans stöder dessa resultat att fosforreglering genom tandemplatsen S308/S310 spelar en viktig roll för CAP1 för att främja motilitet och invasion av cancerceller i bukspottkörteln.
Effekter av WTCAP1 och fosformutanter för att rädda den minskade motiliteten och invasionen i CAP1-knockdown PANC-1 celler. (A) WTCAP1 och AA-mutanten räddade effektivt den minskade motiliteten i CAP1-knockdown PANC-1-cellerna i Transwell-migrationsanalyser, medan DD-mutanten misslyckades med detta. Experimenten, datainsamlingen och analyserna genomfördes på samma sätt som beskrivs i figur 2. Felstaplarna representerar S.E.M. och ”*” anger P < 0,05 jämfört med kontrollcellerna som bär en tom vektor (Vec-R). (B) WTCAP1 och AA-mutanten räddade effektivt den minskade Matrigelinvasionen hos de CAP1-nedsläckta PANC-1-cellerna, medan DD-mutanten inte heller gjorde det. Experimenten, datainsamlingen och analyserna genomfördes på samma sätt som i fig. 2. Felstaplarna representerar S.E.M. och ”*” anger P < 0,05 jämfört med kontrollcellerna. (C) Återexpression av WTCAP1 räddade också det uppreglerade E-Cadherin i CAP1-knockdown PANC-1-cellerna.
Evidens som stödjer att CAP1 medierar extracellulära tillväxtfaktorsignaler för att kontrollera cancercellers invasivitet
Fysiologiska stimuli, såsom tillväxtfaktorerna PDGF och HGF (Hepatocyte Growth Factor)36, är kända för att stimulera omarrangemang av aktincytoskelettet och cellmigration. Eftersom fosforreglering vid S308/S310 är avgörande för CAP1:s funktioner när det gäller att reglera aktincytoskelettet och cancercellers invasivitet, undersökte vi möjligheten att dessa stimuli kan reglera CAP1:s fosforylering och genom detta styra aktincytoskelettets omarrangemang och cancercellers invasivitet. Intressant nog minskade behandling av serumstinna PANC-1- och AsPC-1-celler med PDGF S308/S310-fosforylering på CAP1, mest anmärkningsvärt vid 5-minuterstidpunkten (fig. 6A,B). Behandling av pankreascancerceller med HGF eller serum hade ingen betydande effekt för att inducera defosforylering av CAP1 (kompletterande figur 2; visas för PANC-1-celler). Därför är signalering genom CAP1 sannolikt åtminstone delvis ansvarig för att PDGF stimulerar aktincytoskeletalreorganisering och cancercellers invasivitet. Dessa resultat överensstämmer också med uppfattningen att avfosforylerad CAP1 är den ”aktiva” formen, vilket antyds av flera bevislinjer inklusive cofilinbindning, subcellulär lokalisering av fosformutanterna och förhöjd fosforylering av CAP1 i celler som odlas i suspension24. Övergående fosforylering vid tandemregleringsplatsen, dvs. cyklingen mellan den fosforylerade och avfosforylerade formen, tros dock vara nödvändig för optimala cellulära funktioner hos CAP124. CAP1-defosforyleringssignalerna fungerar sannolikt tillsammans med CAP1-fosforyleringssignalerna för att reglera CAP1-cellfunktioner genom att driva transient fosforylering vid S308/S310.
PDGF-inducerad defosforylering av CAP1 i pankreascancerceller. (A) Behandling av serumstinna AsPC-1 cancerceller med PDGF inducerade CAP1 defosforylering vid S308/S310. Cellerna odlades över en natt, serumstarkades i 24 timmar, följt av behandling med 30 ng/ml PDGF under angivna tidsperioder. Celllysat framställdes och användes i Western blotting med en fosforspecifik antikropp som detekterar fosforsignaler på båda resterna av tandemregleringsplatsen på CAP1. Defosforyleringseffekten var mest signifikant vid 5-minuterstidpunkten för PDGF-behandlingen. (B) Behandling av serumstinna PANC-1-celler med PDGF inducerade också en anmärkningsvärd CAP1-defosforylering, på liknande sätt som för AsPC-1-celler. Behandling av celler och Western blotting utfördes enligt samma procedurer som för AsPC-1-celler. GAPDH fungerade som lastningskontroll i Western blot.
Depletion av CAP1 i pankreascancerceller minskade FAK-aktiviteten men orsakade inte förändringar i ERK eller cellproliferation
Vi har nyligen identifierat en ny roll för CAP1 i regleringen av bröstcancercellernas proliferation, där depletion av CAP1 utövar cellkontextberoende effekter på proliferationen, tillsammans med konsekventa förändringar i ERK-aktiviteten18. Vi testade om CAP1 också kan reglera ERK och proliferation i pankreascancerceller. Inga signifikanta förändringar i uttrycket eller fosforyleringen av ERK upptäcktes i de stabila CAP1-knockdown PANC-1-klonerna jämfört med kontrollcellerna (kompletterande figur 3A). Vi utförde också MTT-analyser som testade proliferation av S2-1 och S3-3 stabila knockdown-celler och jämförde dem med kontrollcellerna (Vec), och upptäckte något minskade hastigheter för cellproliferation i knockdown-cellerna (kompletterande fig. 3B). Skillnaderna var dock statistiskt obetydliga, med P-värdena som jämför O.D. (vid 570 nm) mellan S2-1-celler och kontrollceller på 0,219, och den mellan S3-3-celler och kontrollceller på 0,223. Dessa resultat tyder på att CAP1 inte spelar någon betydande roll i regleringen av proliferationen i cancerceller i bukspottkörteln. Med tanke på den allmänna tendensen att stabila knockdown-paradigmet är känsligt för klonvariationer, genererade vi dessutom pooler av CAP1-stabila knockdown-PANC-1-celler, som tros återspegla effekterna av CAP1-depletion på ERK mer exakt genom att undvika potentiell påverkan från selektionsbias. Som visas i fig. 7A skapades pooler av stabila PANC-1-celler med effektiv CAP1-nedbrytning, som härrörde från både S2- och S3 shRNA-konstruktionerna, efter selektion med neomycin, vilket bekräftades i Western Blotting. I överensstämmelse med resultaten från användningen av stabila knockdown-kloner upptäcktes inga anmärkningsvärda förändringar i ERK-uttrycket eller dess fosforylering i knockdown-poolcellerna jämfört med kontrollpoolcellerna.
CAP1-knockdown PANC-1 poolceller hade minskad FAK-aktivitet och celladhesion, men inga förändringar i ERK. (A) CAP1-knockdown PANC-1 poolceller, som härrörde från både S2 och S3 shRNA-konstruktioner, uppvisade inte förändrat ERK-uttryck eller aktivitet jämfört med kontrollpoolcellerna som bar en tom vektor, vilket detekterades i Western Blotting. ERK-aktivitet detekterades i Western Blotting med hjälp av en fosforspecifik antikropp mot platserna Thr202/Tyr204. GAPDH fungerade som laddningskontroll. (B) Minskad FAK-aktivitet upptäcktes i CAP1-knockdown PANC-1 poolcellerna jämfört med kontrollpoolcellerna. FAK-aktiviteten bedömdes genom fosforylering vid Tyr397 med hjälp av en fosforspecifik antikropp mot platsen i Western blotting. (C) CAP1-knockdown poolceller hade minskad celladhesion vid de testade tidpunkterna (45 minuter och 2 timmar) efter att cellerna plomberats på fibronectinbelagda plattor. Ungefär 2 × 104 celler plottades ut på varje brunn i en 6-brunnsplatta, och celler som inte fästes vid de angivna tidpunkterna tvättades bort. Antalet fastsatta celler räknades i fem slumpmässiga fält i ett fasmikroskop och bilder togs. (D) Data som samlats in från tre oberoende celladhesionsanalyser analyserades med hjälp av Students t-test och plottades på grafen där felstaplarna representerar standardavvikelsen. ”**” Indikerar P < 0,01 jämfört med kontrollcellerna som bär den tomma vektorn.
Knockdown av CAP1 i bröstcancerceller orsakade distinkta förändringar i FAK i de metastatiska och icke-metastatiska bröstcancercellerna18. Vi upptäckte också minskad FAK-aktivitet, utan förändringar i FAK-uttrycksnivåerna, i CAP1-knockdown PANC-1 poolcancerceller (Fig. 7B). Baserat på dessa resultat testade vi vidare effekterna av CAP1-depletion på celladhesion i adhesionsanalyser, på liknande sätt som vi gjort tidigare12,18. Vi fann att CAP1-knockdown poolcellerna som härrörde från båda shRNA-konstruktionerna hade anmärkningsvärt minskad celladhesion jämfört med kontrollcellerna (fig. 7C). Vid båda tidpunkterna (45 minuter och 2 timmar) efter det att cellerna hade plottats ut på en fibronectinbelagd yta fäste betydligt fler kontrollceller jämfört med CAP1-knockdown poolcellerna. Vidare hade fler av de fästade kontrollcellerna också spridit sig helt och hållet (utvecklade lamellipodier och cellerna är inte lika ljusa) jämfört med CAP1-knockdown-cellerna (fig. 7C). Vi poängsatte antalet fastsatta celler från tre fält för jämförelse, och data från tre oberoende experiment kvantifierades enligt diagrammet (fig. 7D).