Frontiers in Molecular Biosciences

Molecular Chaperones

Molekylära chaperoner består av ett brett spektrum av proteiner som spelar en viktig roll i cellulär homeostas och som är ansvariga för att hjälpa till med proteinveckningen, sammansättning av multimera proteiner, translokation av proteiner inom och mellan celler, nedbrytning av oönskade eller felveckade proteiner under normala cellulära processer och stabilisering av proteiner genom att förhindra aggregering och hjälpa till med återveckning under stressförhållanden (Lindquist, 1986); Lindquist och Craig, 1988).

Proteiner som rapporterats ha chaperonaktivitet upptäcktes ursprungligen som sådana som överuttrycktes under värmeschock och benämndes därför som värmeschockproteiner (Hsp). Förutom värmeschock är det också känt att andra stressförhållanden, t.ex. kol-, kväve- eller fosfatbegränsande förhållanden, inducerar molekylära chaperoner. Dessa proteiner klassificeras enligt sin molekylvikt i fem huvudfamiljer: (a) Hsp100-familjen, (b) Hsp90-familjen, (c) Hsp70-familjen, (d) Hsp60-familjen och (e) familjen små värmeschockproteiner (sHsp) (Bohen et al., 1995; Schirmer et al., 1996; Bukau och Horwich, 1998). Chaperonerna klassificeras också utifrån deras verkningssätt i: (a) Foldaser, Chaperoner som hjälper till att återveckla oveckade proteiner med hjälp av ATP, t.ex. Hsp70 och Hsp60, b) Holdaser, Chaperoner som binder veckningsintermediärer och förhindrar aggregering, t.ex. sHsp och Hsp40, och c) Disaggregeringar, Chaperoner som aktivt sönderdelar skadliga proteinaggregat, vilket kan leda till att de blir små fragment, t.ex. medlemmar av AAA + ATPase superfamiljen och Hsp100. Denna typ av klassificering gäller med få undantag (Richter et al., 2010; Kim et al., 2013). En stor del av vår förståelse av mekanismerna för chaperonassisterad proteinveckning har härletts från arbetet med chaperonfamiljerna Hsp60 och Hsp70. Denna översikt fokuserar på Hsp60-klassen av molekylära chaperoner och lyfter fram Hsp60 med atypisk struktur och funktion.

Hsp60-familjen/Hsp60-familjen/Chaperoniner

De 60 kDa stora chaperonerna bildar stora oligomeriska ringar och kallas också för chaperoniner. Chaperoniner kan vidare underklassificeras i två grupper på grundval av kravet på co-chaperoniner och deras cellplacering. Chaperoniner av typ I finns i cytoplasman hos prokaryoter och i mitokondrien och kloroplasten hos eukaryoter. De behöver hjälp av co-chaperonin, dvs. Hsp10, som fungerar som ett lock på ringen. Det välstuderade chaperoninet av typ I är känt som GroEL-GroES-systemet i Escherichia coli. Dess homologer är Cpn60/Cpn20 i kloroplaster och mtHsp60/mtHsp10 i mitokondrier (Cheng et al., 1989; Hayer-Hartl et al., 1995; Dickson et al., 2000). Chaperoniner av typ II finns i cytoplasman hos eukaryoter och i arkebakteriella mikroorganismer. De har ett inbyggt lock och behöver därför inga co-chaperoniner för sin funktion (Ranson et al., 1998). Exempel på chaperoniner av typ II är det eukaryota TriC/CCT-maskineriet (TCP-1 ringkomplexet/chaperonin innehållande TCP-1-komplexet), som består av åtta subenheter, och termosomen i arkeabakterier. Till skillnad från typ I-chaperoniner kräver substratoberoende fångst av typ II-chaperoniner hjälp av prefoldin och Hsp70-homologer (Iizuka et al., 2004; Cuéllar et al., 2008). Nyligen rapporterades en tredje grupp som kallas typ III-chaperoniner och som strukturellt liknar typ II-chaperoniner men som mekaniskt och fylogenetiskt skiljer sig från både typ I- och typ II-chaperoniner, t.ex. Carboxydothermus hydrogenoformans chaperonin (Ch-CPN) (Techtmann och Robb, 2010; An et al., 2017; figur 1). Chaperoninerna av typ I, II och III kallas också för chaperoniner av grupp I, II och III.

Structure-Function of Type I Chaperonins: Prokaryotic Cytosol

E. coli GroEL-GroES

Strukturella och funktionella studier av E. coli GroEL har visat att den bildar en tetradecamerisk struktur som består av två heptameriska ringar som är staplade på varandra och bildar en kavitet, som ändrar sin karaktär från att vara huvudsakligen hydrofob till hydrofil när den binder GroES. Föjning av substratprotein sker i detta hålrum med hjälp av co-chaperonin GroES, som är en kapselliknande heptamerisk struktur (Mande et al., 1996). Varje GroES-monomer har en storlek på 10 kDa. GroEL-monomeren är indelad i tre domäner, nämligen den apikala, intermediära och ekvatoriella domänen. Varje monomer är ~57 kDa stor.

Det finns två modeller föreslagna för den GroEL-GroES-medierade substratproteinveckningen. Asymmetrisk/sekventiell modell, som är allmänt accepterad. I denna modell förekommer GroEL och GroES stökiometriskt i förhållandet 2:1 (förhållandet 14:7 underenheter). I den andra modellen som kallas den symmetriska/simultana modellen, som bygger på det nyligen observerade GroEL-GroES-komplexet, är GroEL:s båda ringar täckta av co-chaperonin GroES i det stökiometriska förhållandet 1:1, dvs. (GroEL-GroES)2, och underenhetsförhållandet 14:14 (Sameshima et al., 2008; Ye och Lorimer, 2013; Fei et al., 2014). Symmetriska (GroEL-GroES)2-komplex har observerats både i närvaro och frånvaro av substratprotein, vilket tyder på ett övergående mellanliggande tillstånd i veckningsreaktionscykeln.

Struktur-funktion hos Chaperoniner av typ I: Endosymbiotiska organeller

Kloroplast- och mitokondriella Chaperoniner

Kloroplast-chaperoninerna benämns vanligen som Cpn60 (GroEL-homologer) och Cpn10 (GroES-homologer). Cpn60-chaperoninerna består av flera underenheter som är divergerade i två besläktade men distinkta α- och β-typer (Dickson et al., 2000; Hill och Hemmingsen, 2001). I motsats till bakteriella chaperoniner, som innehåller flera underenheter och föredrar homo-oligomerisering (Ojha et al., 2005; Gould et al., 2007), bildar kloroplastchaperoniner hetero-oligomerer med sina två typer av chaperonin α och β-underenheter. Heterogenitet finns också i co-chaperoninstrukturen. Cpn10 liknar standardco-chaperonin och bildar en heptamerisk enkelring av 10 kDa-underenheter (Koumoto et al., 2001; Sharkia et al., 2003). Cpn20 har två Cpn10-liknande polypeptidsekvenser som är sammanfogade i tandem. Den renade Cpn20 existerar som en tetramer ringliknande struktur som innehåller 20 kDa underenhet. Den är fullt funktionell in vitro och hjälper till att återforma denaturerat protein i närvaro av både kloroplast Cpn60 och E. coli GroEL (Tang et al., 2006). Dessutom hjälper Chlamydomonas reinhardtii Cpn10 GroEL endast i närvaro av Cpn20 (Tsai et al., 2012). Således finns det en betydande heterogenitet i den oligomeriska sammansättningen av kloroplastchaperoniner.

Den mänskliga mitokondriella chaperonin, mtHsp60, är känd för att ha en proteinveckningsmekanism (mitokondriellt protein) som skiljer sig från GroEL-GroES-systemet och kräver en enda heptamerisk ring för att utföra sin proteinveckningsfunktion tillsammans med sin co-chaperonin, mtHsp10 (Viitanen et al., 1992; Nielsen och Cowan, 1998). Kristallstrukturen av mitokondriellt chaperonin i komplex med sitt co-chaperonin, mtHsp60-mtHsp10, visar dock ett unikt mellanstadium där mtHsp60-mtHsp10 bildar en symmetrisk fotbollsliknande struktur med dubbla ringar, (mtHsp60)14 + 2 (mtHsp10)7.

Typ I Chaperoniner: Icke-kanoniska egenskaper

Multipla Chaperoniner inom olika arter

En analys av fullständigt sekvenserade genomer tyder på att cirka 30 % av alla genomiska sekvensdata har flera kopior av gensekvenser som kodar för chaperoniner (Lund, 2009; Kumar et al, 2015). Fördelningen av dessa multipla chaperoniner baserat på omfattande fylogenetisk analys tyder på att multipla kopior av chaperoningener förekommer främst i fem fylor, nämligen (a) fylum Actinobacteria, (b) fylum Firmicutes, (c) fylum Cyanobacteria, (d) fylum Chlamydia och (e) α-Proteobacteria phylum (Kumar et al, 2015).

Aktinobakterier

Aktinobakterier är grampositiva bakterier och har ett högt G + C-innehåll i sina genomer, t.ex. Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae och Bifidobacterium longum. Dessa arter har vanligtvis två kopior av chaperoningener, där en av kopiorna finns i en operonliknande struktur. Den andra kopian av Cpn60 existerar som en oberoende gen utan närvaro av Cpn10-genen (Rinke de Wit et al., 1992). De aktinobakteriella chaperonin-generna står under reglerande kontroll av transkriptionsfaktorn HrcA som binder till uppströms CIRCE-sekvensen (controlling inverted repeat of chaperone expression) (Duchêne et al., 1994; Grandvalet et al., 1998). I vissa fall förmedlas regleringen genom att transkriptionsfaktorn HspR binder till uppströms HAIR-sekvensen (HspR Associated Inverted Repeat) (Barreiro et al., 2004).

Firmicutes

Firmicutes är grampositiva bakterier och besitter ett lågt G + C-innehåll i sina genomer, t.ex. Staphylococcus aureus, Desulfitobacterium dehalogenans och C. hydrogenoformans. Firmicutes är kända för att ha både prokaryotiska typ I-gener för chaperonin och arkaeliska gener för chaperonin som klassificeras som typ III-chaperonin. Typ I-chaperoniner är arrangerade i ett operoniskt arrangemang med co-chaperonin, medan typ III-chaperoningenen är placerad i dnaK-operonet. Både typ 1 och typ III chaperonin generna regleras av HrcA transkriptionsfaktor (Techtmann och Robb, 2010).

Chlamydiae

Chlamydiae är mestadels obligata intracellulära patogener, t.ex. Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumonia och Chlamydia psittaci. Chlamydia-arter har tre kopior av chaperoningener (McNally och Fares, 2007). Operoniskt arrangemang tyder på att endast en kopia av chaperoningenenerna existerar tillsammans med dess co-chaperonin. Andra chaperoningener är dock lokaliserade separat. Regleringen av klamydiens chaperoningener är komplex. Den första kopian av chaperoningenen induceras av värmeschock och regleras av HrcA-CIRCE-systemet. Den andra kopian av chaperoningenen induceras när Chlamydia befinner sig i monocyter eller makrofager (Kol et al., 1999) och den tredje kopian av chaperoningenen induceras när Chlamydia befinner sig i Hep-2-celler (Gérard et al., 2004). Sådana typer av uttryck och reglering av chaperoningener tyder på livscykelspecifika mönster och oberoende funktionella roller för dem.

α-proteobakterier

Rhizobia, som tillhör klassen α-proteobakterier, är symbiotiska organismer som lever i förening med baljväxter i rotknölarna och är involverade i kvävefixering, t.ex. Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum. Rhizobier innehåller flest kopior av chaperoniner. B. japonicum har sju kopior av chaperoningener (Fischer et al., 1993). R. leguminosarum är en välkaraktäriserad organism och har tre kopior av chaperoningener. Genarrangemanget i alla dessa organismer tyder på att de tre kopiorna av chaperoningenen bildar separata operoner med sina respektive co-chaperoningener (George et al., 2004). En av chaperoninoperonerna är belägen på den genomiska ö som innehåller gener som är involverade i kvävefixering. Det regleras av NiF-faktorer som reglerar kvävefixeringsgener (Ogawa och Long, 1995). Den andra kopian av chaperoningenen är inte välstuderad och är känd för att vara involverad i chaperonegenskapen hos flera modellsubstratproteiner (George et al., 2004).

Cyanobakterier

Cyanobakterier är till stor del fotosyntetiska bakterier, t.ex. Synechococcus platensis, Prochlorococcus marinus och Anabaena variabilis. Ungefär 90 % av genomsekvenserna hos cyanobakteriearterna innehåller två kopior av chaperoningener där en av dem är arrangerad på en operon medan den andra chaperoningenen kodas separat. Vissa cyanobakteriearter innehåller tre kopior av chaperoningener, där två av dess chaperoningener är placerade tillsammans med respektive co-chaperoniner i operonet medan den tredje kopian av chaperoningener är oberoende (Lund, 2009; Kumar et al., 2015). Chaperoningener som finns i operoniskt arrangemang med sina co-chaperoniner är essentiella gener medan de som finns oberoende av co-chaperonin är icke-essentiella (Sato et al., 2008). De två cyanobakteriella chaperoningenerna regleras positivt av RpoH och negativt av HrcA-proteiner. Vid värmeschock induceras en av chaperoningenerna snabbt medan den andra chaperoningenen induceras gradvis (Kojima och Nakamoto, 2007; Rajaram och Apte, 2010). Den chaperonin-gen som induceras gradvis vid värmeschock är känd för att vara direkt involverad i fotosyntesen.

Evolutionär linje

I takt med att fler genomiska sekvenser blir tillgängliga tyder analysen av chaperonin-gener på att distributionen och frekvensen av multipla kopior av chaperonin-gener i olika fyler och organismer fortsätter att öka (Lund, 2009; Kumar et al., 2015). För att förstå orsaken till mångfalden av chaperoningener är antingen på grund av horisontell genöverföring eller genduplikation utfördes fylogenetisk analys av GroEL-proteiner över arter, vilket avslöjade att orsakerna till förekomsten av flera kopior av GroEL inte är enhetliga. I ett fåtal fall förekommer genduplicering följt av evolutionärt urval, vilket observerades i myxobakteriella GroELs, mykobakteriella första och andra kopior av GroEL och ett fåtal rhizobiella GroELs. När det gäller den tredje mykobakteriella GroEL-homologen, några få rhizobiella GroEL och metanosarcinala GroEL förekom horisontell genöverföring (Goyal et al., 2006; Kumar et al., 2015).

Det har tidigare föreslagits i vårt labb att mykobakteriella GroEL har duplicerats och genomgått olika selektiva tryck för att utföra distinkta strukturella och funktionella roller under evolutionens gång (Goyal et al., 2006). Biofysiska och biokemiska studier på rekombinant renade GroELs från M. tuberculosis har visat att GroEL1 och GroEL2 existerar som lägre oligomeriska arter i motsats till den tetradekameriska GroEL-strukturen hos E. coli (Qamra et al., 2004). Kristallstrukturen av M. tuberculosis GroEL2 i sin dimeriska form belyste närvaron av distinkta rester vid gränssnittsregionen, som troligen är ansvariga för förändringen i oligomeriseringen (figur 2; Qamra och Mande, 2004). Studier av genombyte och domänbytesstudier på M. tuberculosis GroEL1 tyder på att den ekvatoriala domänen är ansvarig för den misslyckade oligomeriseringen. Den apikala domänen tål stora insättningar och deletioner (Kumar et al., 2009). Ungefär samtidigt visades att GroEL1 har utvecklats för att promiskuöst binda nukleinsyror (Basu et al., 2009) och att oligomerisering underlättas av fosforylering av serinrester (Kumar et al., 2009). Eftersom GroEL2 är känd för att vara ett essentiellt chaperonin i mykobakterier, medan den oligomeriska sammansättningen av GroEL1 regleras posttranslationellt, rapporterades det att tetradekamerisk sammansättning och exakt kommunikation mellan domänerna är en förutsättning för chaperoninaktivitet (Chilukoti et al., 2015).

Funktionell mångfald

Det är viktigt att undersöka om närvaron av flera kopior av chaperoniner är ansvariga för att de beter sig som kanoniska chaperoniner eller om de har divergerat för att utföra nya funktioner. Det är också viktigt att notera om dessa multipla chaperoniner verkar på gemensamma substrat eller på skilda pooler av substrat. GroEL är mycket konserverade hos olika arter och det har visats att homologer av chaperoniner från andra bakterier kan fungera i E. coli, vilket tyder på att substratproteinerna överlappar varandra och att GroEL-funktionen har en gemensam mekanism. Interaktionerna mellan substratproteiner och GroEL är hydrofoba till sin natur, så konformationsförändringar som medierar exponering av de apikala och ekvatoriala domänerna i kaviteten spelar en nyckelroll vid substratigenkänning och underlättar proteinveckningen. Bindning av substratproteiner till GroEL sker genom α/β-domäner av proteiner utan sekvenslikhet (Kerner et al., 2005; Kumar och Mande, 2011) och ytterligare studier tyder på att GroEL selektivt binder globulära substrat snarare än förlängda polypeptider (Robinson et al., 1994; Goldberg et al., 1997). Flera kopior av chaperoniner i en organism har också rapporterats ha utvecklats för att utföra nya funktioner. GroEL-homologen i en insektssymbiont, Xenorhabdus nematophila, har visat sig vara giftig för insekter, vilket förmedlas genom bindning till alfa-chitin. Mutationsanalys av dessa GroEL-homologer tyder på att den aminosyra som är kritisk för denna typ av aktivitet skiljer sig från den essentiella chaperoninen (Joshi et al., 2008). I M. tuberculosis fungerar GroEL2 som en generalistisk chaperonin (Hu et al., 2008) medan GroEL1 rapporteras vara associerad med nukleoider (Basu et al., 2009). Således är det uppenbart att genduplicering av groEL-gener har lett till den funktionella mångfalden av chaperoniner och/eller distinkt substratspektrum för intracellulär proteinveckning.

Posttranslationella modifieringar/Biofilmsbildning

Posttranslationella modifieringar i proteiner används av organismer för att modulera sina fysiologiska processer och anpassa sig till en ständigt föränderlig miljö (Bernal et al., 2014). Chaperoniner har rapporterats vara posttranslationellt modifierade i vissa organismer, och denna modifiering har rapporterats leda till vinst/förlust av deras funktion. Till exempel har fraktionering av M. tuberculosis cellysat visat att tetradekammarform av GroEL1 uppnås endast vid fosforylering vid serinrester (Kumar et al., 2009). På samma sätt har det i en annan rapport visats att fosforylering sker vid treoninrester (Canova et al., 2009). Båda dessa observationer tyder på att oligomerisering av GroEL1 är ett resultat av posttranslationell modifiering.

Många patogener undviker det medfödda immunförsvaret och blir resistenta mot antibiotika genom att bilda biofilmer på epitelceller (Hall-Stoodley och Stoodley, 2005). GroEL:s roll i biofilmsbildningen har belysts i ett fåtal organismer. Till exempel misslyckas GroEL1-mutant av M. smegmatis med att bilda biofilm. Mekanistiska studier visade att M. smegmatis GroEL1 interagerar med enzymet KasA, som är kritiskt för biosyntesen av mykolsyra som är involverad i biofilmsbildningen (Ojha et al., 2005). Intressant nog har det nyligen rapporterats att GroEL i den patogena stammen B. anthracis fosforyleras och därmed modulerar biofilmsbildningen. Dessa fynd belyser att fosforylering av GroEL har funktionella implikationer (Arora et al., 2017). Acetylering är en annan posttranslationell modifiering som förknippas med E. coli- och M. tuberculosis-chaperoniner, men en funktionell roll har ännu inte tillskrivits denna modifiering (Liu et al., 2014). På samma sätt genomgår mitokondriellt co-chaperonin (mtHsp10) acetylmodifiering och kontrollerar veckningen av mitokondriella proteiner under förhållanden med överskott av näringsämnen (Lu et al., 2015).

C-terminal mångfald

Flera studier lyfter fram betydelsen av GroEL:s C-terminala rester för chaperoninets övergripande funktion (Tang et al., 2006; Chen et al., 2013). I de fall som avser flera kopior av chaperoniner har de olika mönster av C-terminala rester. Medan GroEL:s C-terminus (från E. coli) har ett motiv med 13 rester (GGM)4M, har GroEL-homologer från andra organismer (som innehåller flera kopior av chaperoniner) distinkta C-terminala motiv, t.ex.:

a) Histidinrik C-terminal, t.ex. mykobakterier (Colaco och MacDougall, 2014)

b) Mönsterslös C-terminal, t.ex, Rhizobia (George et al., 2004)

c) Liknande (GGM)4M-upprepningar, t.ex. Myxobacteria (Wang et al., 2013)

d) Avsaknad av GGM-liknande svans, t.ex. Methanosarcina (Figueiredo et al., 2004)

Det framgår tydligt att många chaperoninparaloger i olika organismer har GGM-liknande C-terminus. Ett brett spektrum av genomisk organisation ses hos dessa chaperoniner. Dessutom ses också skillnader i deras samexpression med andra chaperoniner och i deras funktioners väsentlighet. Dessa paraloger observeras alltså på ett förbryllande sätt vara antingen viktiga eller oviktiga, samuttryckta med sin co-chaperonin eller inte samuttryckta, och fungerar möjligen som hushålls-chaperoniner. Å andra sidan har chaperoniner som inte har GGM-liknande C-terminus möjligen utvecklats för att utföra nya funktioner (Ojha et al., 2005; Wang et al., 2013; figur 3).

Slutsatser

Typ I chaperoniner är viktiga genom sin roll i den intracellulära proteinveckningen. GroEL-GroES-systemet i bakterier hjälper till att vika cirka 10-15 % av cytosoliska proteiner. Olika strukturer av GroEL som lösts i apo-form, nukleotidbunden form samt i komplex med co-chaperonin GroES försöker förklara dessa chaperonins roll i proteinveckningen (Saibil et al., 2013). Förekomsten av flera chaperoniner och deras roll i olika funktioner tyder på ett evolutionärt tryck mot anpassning till olika miljöförhållanden. Strukturen hos M. tuberculosis GroEL2 belyser ett lägre oligomeriskt tillstånd och mer exponerade hydrofoba ytor, troligen för att öka substratpoolen och energihushållningen (Qamra och Mande, 2004; Qamra et al., 2004; Kumar och Mande, 2011). På grund av närvaron av en histidinrik C-terminal i flera chaperoniner har dessa föreslagits bidra till alternativa biologiska funktioner. M. smegmatis GroEL1 som binder till järn kan bidra till biofilmsbildning (Ojha et al., 2005). Överlevnadsdefekt hos M. tuberculosis groEL1 knockout-stam under förhållanden med låg lufttillförsel kan bidra till syreavkänning genom att direkt binda till metaller eller hjälpa vissa metallproteiner att veckas (Sharma et al., 2016). Strukturen hos andra homologa chaperoninproteiner kommer troligen att besvara den myriad av frågor som är förknippade med de nya funktionerna hos chaperoninhomologer.

Författarbidrag

Alla författare som anges har gjort ett väsentligt, direkt och intellektuellt bidrag till arbetet, och godkänt det för publicering.

Intressekonfliktförklaring

Författarna förklarar att forskningen utfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

MYA tackar för det ekonomiska stödet för Senior Research Fellowship från Department of Biotechnology (DBT), Ministry of Science and Technology, Government of India. Författarna vill tacksamt tacka för det ekonomiska stödet till arbetet i SCM-laboratoriet genom bidragen BT/PR15450/COE/34/46/2016 och BT/PR3260/BRB/10/967/2011 från DBT.