Kartläggning av MAP7:s roll i axonens förgrening

Neuroner har olika och distinkta dendritiska och axonala morfologier. En korrekt utveckling av dessa strukturer är avgörande för normal funktion och konnektivitet. Onormal neuronal morfologi har faktiskt kopplats till olika neurobiologiska och psykiatriska störningar (Luo och O’Leary, 2005). Utvecklingen av olika axonala morfologier beror på de växande axonernas förmåga att reagera på extracellulära signaler. Dessa signaler inducerar lokaliserad cytoskelettomvandling för axonernas vridning och förgrening (Armijo-Weingart och Gallo, 2017).

Axonernas utveckling i DRG:s sensoriska neuroner är mycket stereotyp och utgör därför en bra modell för att förstå mekanismen för axonförgrening. Dessa sensoriska axoner förgrenar sig vid inträdet i ryggmärgen, och dotteraxoner sträcker sig antingen framåt eller bakåt. Det främre växande axonet kommer att stiga uppåt för att överföra sensorisk information som är avsedd för hjärnan. Dessutom kommer stigande och fallande axongrenar att generera interstitiella axonkollateraler som bildas av ett etablerat axonaxel för att innervera olika lameller längs den dorsal-ventrala axeln i ryggmärgen (Gibson och Ma, 2011).

I det senaste arbetet av Tymanskyj et al. (2017) har man försökt att identifiera proteiner som förmedlar axonal förgrening i DRG-sensoriska neuroner. För att göra detta jämförde de transkriptionsprofiler av DRG-neuroner före och efter att kollaterala grenar bildats. Eftersom microtubule associated protein 7 (MAP7) var starkt uppreglerat efter kollaterala bildningar undersökte författarna därefter effekterna av överuttryck och knockdown av MAP7 på primära sensoriska neuronkulturer som skördats vid tidiga och sena embryonala stadier. Övexpression av MAP7 ökade antalet interstitiella grenar i yngre neuroner som vanligtvis inte uttrycker MAP7. Omvänt resulterade knockdown av MAP7 i äldre neuroner som odlades efter grenbildning in vivo i färre interstitiella grenar in vitro. Dessa experiment visade att MAP7 är både tillräcklig och nödvändig för interstitiell förgrening i sensoriska neuroner.

Tymanskyj et al. (2017) resonerade att en regulator av grenbildning sannolikt skulle lokaliseras till regioner av ett axon där grenar uppstår. Författarna fann faktiskt en stark preferens för MAP7 vid grenpunkter. Eftersom begynnande grenar bildas av filopoder som stabiliseras av mikrotubulipenetration, skulle tidpunkten för MAP7:s lokalisering till grenpunkterna antyda dess roll som styr tidpunkten och mönstret för grenbildningen. Författarna utförde därför live-avbildning och fastställde att fluorescerande märkt MAP7 saknades i pionjärfilopoder, men hade fördröjt inträde i nya mikrotubulberberikade grenar. Ytterligare arbete visade att MAP7 företrädesvis lokaliserades till långa och stabila grenar. Tillsammans tyder dessa studier på att MAP7 är kritisk för mognad av grenar, men troligen inte för den initiala grenbildningen.

Och även om dessa in vitro-manipulationer etablerade en roll för MAP7 i kollaterala förgreningar, försökte författarna styrka detta genom att använda en musmutant där MAP7-proteinet är trunkerat vid C-terminalen (MAP7mshi) (Turner et al., 1997). MAP7:s C-terminus har tidigare visat sig interagera med kinesin (Sung et al., 2008; Barlan et al., 2013). Därför resonerade Tymanskyj et al. (2017) att detta var mekanismen för axonförgrening och att MAP7mshi-neuroner skulle ha färre kollateraler. Överraskande nog hade sensoriska neuroner odlade från MAP7mshi-möss en drastisk ökning av axonförgreningar jämfört med neuroner från kontrolldjur. Detta, i kombination med tidigare in vitro-fynd, tyder starkt på att MAP7:s N-terminus, och inte C-terminus, är avgörande för att främja axonens kollaterala förgrening. Det är förbryllande att om C-terminus var obehövlig för att främja förgrening skulle det vara rimligt att anta att MAP7mshi-neuroner skulle likna kontrollneuroner, men i stället resulterar förlusten av MAP7:s C-terminus i en förstärkning av den kollaterala förgreningsprocessen. En förklaring är att en C-terminal domän blockerar N-terminal funktion och att förlust av C-terminalen leder till överdriven förgrening. Det är också möjligt att C-terminal trunkering ger onormalt höga nivåer av MAP7-protein i de muterade mössen, vilket främjar axonförgrening i likhet med överexpression av MAP7 in vitro. Även om Tymanskyj et al. (2017) använde in situ-analys och RT-PCR för att bekräfta närvaron av det trunkerade mRNA:t i MAP7mshi-djur är de jämförbara uttrycksnivåerna av MAP7 oklara. Den exakta regulatoriska rollen för C-terminus kommer således att kräva ytterligare studier.

En viktig upptäckt från MAP7mshi-djuren kom från analys av DRG-sensoriska neuronprojektioner. Sensoriska neuroner måste korrekt innervera både perifer målvävnad, såsom hud och muskler, och ryggmärgen genom att bilda ett antal axonkollateraler i båda regionerna för att få en korrekt känslighet för externa stimuli. Intressant nog uppvisade MAP7mshi-möss ett ökat antal axonkollateraler som förgrenade sig till ryggmärgen jämfört med kontrolldjur, medan antalet kollateraler i framfoten var normalt. Den avvikande innervation av DRG-axoner i ryggmärgen hos MAP7mshi-möss var förknippad med termisk hyperalgesi, vilket tyder på att DRG-nociceptorer är beroende av MAP7 för korrekt axonbildning. Huruvida andra undertyper av DRG-neuroner kräver MAP7 kräver ytterligare undersökningar. Även om Tymanskyj et al. (2017) odlade en heterogen population av sensoriska neuroner från dissocierade DRG, kompletterade de dessa kulturer med nervtillväxtfaktor (NGF), som ger trofisk faktor för endast en undergrupp av neuronala subtyper (dvs. nociceptorer) (Lallemend och Ernfors, 2012). Andra neuronala subtyper i DRG (t.ex. proprioceptorer) får inte trofiskt stöd från NGF och uteslöts därför från dessa kulturer (Lallemend och Ernfors, 2012). Huruvida både nociceptorer och proprioceptorer är beroende av MAP7 är särskilt intressant eftersom de projicerar till olika mål. Noterbart är dock att Tymanskyj et al. (2017) fann att (1) endast en delmängd grenar uppstod från en MAP7-berikad region, (2) endast en delmängd MAP7-berikade regioner längs axonet producerade grenar, och (3) MAP7mshi-möss hade förgreningsavvikelser i centrala men inte perifera projektioner. Det är alltså troligt att andra faktorer styr grenbildningen i dessa axoner.

Ett omfattande arbete har visat att miljöindikationer formar axonens grenbildning genom att utlösa en mycket reglerad sekvens av cytoskeletala händelser, inklusive bildning av aktinplåster, framväxande av filopodialer och polymerisering och depolymerisering av mikrotubuli (Armijo-Weingart och Gallo, 2017). Mikrotubuli-associerade proteiner (MAPs) kan förmedla cytoskeletala förändringar genom att positivt eller negativt påverka mikrotubulernas stabilitet och buntning (Armijo-Weingart och Gallo, 2017). I likhet med den nya rollen för MAP7 i mognad av sensoriska grenar har tidigare arbete identifierat en roll för MAP7 i Sertoli-cellernas mikrotubulistabilitet och spermatogenes, där avsaknad av MAP7 hos möss leder till manlig sterilitet (Komada et al., 2000; Magnan et al., 2009). Omvänt har Tymanskyj med flera (Tymanskyj et al., 2012; Barnat et al., 2016) identifierat MAP1B som en negativ regulator av axonförgrening och mognad i kortikala och vuxna DRG-neuroner. Dessa arbeten kastar ljus över den mångsidiga proteinverktygslåda som är tillgänglig för de inneboende förgreningsmognadsprogrammen. En spännande fråga är vad som styr konkurrensen mellan positiva och negativa regulatorer för att förmedla grenkonstruktion eller förstörelse.

Lokalt segregerade grenar från en enda neuron kan reagera på tillåtande och/eller begränsande signaler. Som nämnts ovan finner Tymanskyj et al. (2017) att MAP7mshi-möss har avvikande kollaterala förgreningar i ryggmärgen, men inte i framfoten, vilket tyder på att dessa divergerande grenar svarar på olika miljömässiga signaler. Denna uppenbara begränsning av MAP7-funktionen till central, men inte perifer, kollateral förgrening speglar den unilaterala funktionen av SAD-kinaser i central, men inte perifer, innervation i proprioceptiva neuroner, en annan sensorisk neuronsubtyp (Lilley et al., 2013). Lilley et al. (2013) föreslår en modell där SAD-kinaser skulpterar axonala arbors genom sekventiella lång- och kortsiktiga neurotrofinexponeringar. Proprioceptiva neuroner får tonisk långtidsexponering för neurotrofin-3 från perifera mål, t.ex. muskeln, vilket resulterar i en uppreglering av SAD-kinasernas uttryck. Denna uppreglering förbereder axoner för inneboende grenprogrammering, men denna förberedda väg utlöses först efter kortvarig neurotrofin-3-exponering från målneuronerna i ryggmärgen, t.ex. motorneuronerna, för att inducera riklig förgrening i den ventrala ryggmärgen (Lilley et al., 2013). Däremot kan axonmönstring i andra neuronala subtyper styras av olika extracellulära signaler. Det sympatiska nervsystemet, en annan neurotrofinberoende population, reagerar till exempel på två olika neurotrofa signaler i sekventiella steg under axonprojektionen. Sympatiska axoner växer inledningsvis längs blodkärl, ett mellanliggande mål, som utsöndrar ett neurotrofin som främjar axonutvidgningen (Kuruvilla et al., 2004). Vid slutlig innervation utsätts dock axonterminaler för NGF som produceras av målvävnaden. NGF som härrör från målet inducerar en signalomkoppling för att stoppa axontillväxten och uppmuntra förgrening för att möjliggöra en omfattande innervation av målet (Suo et al., 2015). Kanske är MAP7-beroende förgreningsmognad också beroende av antingen (1) en enda axonmönsteringssignal med tidsmässigt och lokalt distinkta mönster eller (2) olika sekventiella signaler från mellanliggande och slutliga mål.

Neurologiska störningar kan vara förknippade med förändrat axonbeteende och hjärnans konnektivitet, vilket bidrar till deras komplexa och multifaktoriella natur. Intressant nog uttrycks MAP7 i embryonala mushjärnor, och fina genetiska kartläggningsstudier visar ett signifikant samband i MAP7-polymorfismer för enskilda nukleotider med schizofreni (Fabre-Jonca et al., 1998; Torri et al., 2010; Venkatasubramanian, 2015). Efter upptäckterna i Tymanskyj et al. (2017) i det perifera nervsystemet kommer det att vara avgörande att undersöka MAP7-regleringen av axongrenarnas mognad i hjärnan för att belysa eventuella samband mellan MAP7 och schizofreni. Utöver utvecklingen av det perifera nervsystemet krävs dessutom axonens kollaterala förgrening i hela nervsystemet och är kritisk för en korrekt ledningsdragning. Tidigare studier visar att aktivering av inneboende cellulära program som främjar mikrotubulipolymerisering kan reglera axonåterväxt och förgrening efter skada positivt (Ruschel et al., 2015). För att urskilja potentiella terapeutiska mål för återväxt av axoner kan framtida undersökningar därför fokusera på MAP7 för att återaktivera intrinsikala utvecklingsprogrammeringar.

.