Kloridjonkanaler och transportörer: från naturens kuriositeter och källan till mänskliga sjukdomar till läkemedelsmål

Det här uppfyller praktiskt taget alla krav från klassrummet till forskningslabbet tills vi tar hänsyn till kloridkanaler. Vi vet att de finns, att de är viktiga och att de skulle kunna vara bra läkemedelsmål inom flera sjukdomsområden, men fram till nyligen har de förblivit något stigmatiserade och omoderna i terapivärlden. Bristen på selektiva ligander har inte alls hjälpt. Det enda undantaget har varit GABA-A-receptorn som är kopplad till en inneboende kloridkanal som öppnas vid bindning av den hämmande neurotransmittorn GABA. Bensodiazepiner har potentierat denna receptor ända sedan Valium blev tillgängligt på 1960-talet, vilket ger lugnande och antikonvulsiva effekter. Detta introducerar ett viktigt begrepp: det finns flera genfamiljer och olika proteintyper som kan beskrivas som kloridkanaler.

Detta står i kontrast till vad vi förstår av katjonselektiva jonkanaler där det finns liten flexibilitet i proteinstrukturen som kan bilda en por som är selektiv för kalium, natrium eller kalcium; mångfalden hos dessa jonkanaler åstadkoms av variationerna i de proteindomäner som är skilda från porerna och som påverkar öppnings- och stängningsförhållandet. För att vara rättvis verkar det inte finnas många fysiologiska skäl till varför en anjonkanal skulle uppvisa kloridselektivitet eftersom det inte finns någon större fysiologisk roll i membrantransporten av andra halogenider eller små anjoner; alla anjonkanaler kommer per automatik att vara kloridkanaler ur fysiologisk synvinkel. Å andra sidan spelar kalium-, natrium- och kalciummembranströmmar olika grundläggande roller, och selektiv membranpermeabilitet för dessa katjoner är avgörande för cellfunktionen och för själva livet.

GABA-A-receptorer tillhör familjen cys-loop pentameriska ligandstyrda jonkanaler, som omfattar flera typer av excitatoriska och inhiberande neurotransmittorstyrda kanaler. CFTR-proteinet (cystic fibrosis transmembrane regulator) är en nukleotidreglerad kloridkanal. Det tillhör den mångsidiga ABC-transporterfamiljen (ATP-binding cassette) och är den enda som inte tycks transportera något substrat över ett membran, utan snarare fungerar som en kloridkanal. CLC-familjen av spänningsstyrda kloridkanaler härstammar från en annan distinkt genfamilj och har en allmän struktur som är unik bland membranproteiner. Denna familj av proteiner har gett upphov till många överraskningar under de senaste 30 åren och medlemmar av denna familj kommer att presenteras här och även hur de kan betraktas som måltavlor för läkemedel.

Andra spännande utvecklingar från kloridkanalområdet har kommit fram efter den molekylära identifieringen av proteiner som ligger till grund för kalciumaktiverade kloridkanaler (ClCa). Funktionsmässigt har vi känt till deras fysiologiska roll under en längre tid, men den senaste tidens molekylära identifiering av kanalproteinerna har gjort det möjligt att utveckla molekylära och farmakologiska verktyg för att undersöka och förändra deras aktivitet. Denna översikt fokuserar på den farmakologiska potentialen av att rikta in sig på ClCa-kanaler och CLC-proteiner; deras funktion och subcellulära lokalisering sammanfattas i figur 1.

En introduktion till CLC-proteiner

De nio medlemmarna i denna proteinfamilj är CLC-1 till 7, CLC-KA och KB. Den grundande medlemmen, CLC-1, är den spänningsstyrda kloridkanalen i skelettmuskulaturen och kommer att diskuteras nedan. Många funktionella studier har utförts på en homolog med hederstiteln CLC-0, som isolerats från Electroplax elektriska organ, som gör det möjligt för rockan att bedöva sina vattenlevande offer. Rekonstruktion av CLC-0 i lipidbilayers och elektrofysiologisk registrering av strömmar som flödar genom enskilda jonkanaler avslöjade en fascinerande egenskap. När man registrerar ström från ett litet membranstycke som innehåller en enda jonkanal observerar man vanligtvis fluktuationer mellan två strömamplituder: den ena representerar den stängda kanalen och den andra representerar strömmen som flyter genom den öppna kanalen. Fluktuationerna återspeglar övergångar mellan öppna och stängda kinetiska tillstånd. Med CLC-0 var det emellertid uppenbart att det enda jonkanalproteinet bestod av två likvärdiga porer som kunde öppnas oberoende av varandra1. Denna kanal beskrevs därför som dubbelspärrad (figur 2). Det var därför ingen större överraskning att kristallstrukturerna av homologer från tarmbakterier avslöjade att proteinkomplexet var en dimer, där varje underenhet hade en jonledningsväg2 (figur 2).

Den andra överraskningen uppstod när detaljerade funktionella experiment utfördes på CLC-ec1 från E. coli. I stället för att fungera som en kloridkanal, som dess sedan länge försvunna släkting i ryggradsdjurens skelettmuskulatur, är CLC-ec1 en 2Cl-/H+-utbytestransportör, eller antiportör, med strikt 2:1-utbytesstokiometri3. Detta protein är viktigt för tarmbakteriers överlevnad vid lågt pH4 och utnyttjar troligen en kloridgradient för att hålla det cellulära pH-värdet på en tolerabel nivå. Prokaryotiska CLC:er kan därför vara måltavlor för hämmare för att behandla patogena E. coli- eller Salmonella-infektioner4. Upptäckten av jonbytesbeteendet stimulerade naturligtvis ytterligare ansträngningar för att fastställa om något av detta klorid-till-proton-utbyte fanns i däggdjurs CLC, med antagandet att Cl-/H+-utbyte kan vara den verkliga funktionen hos arketypiska CLC och att de som identifierats som kloridkanaler bara kan vara undantag från regeln. Detta verkar vara fallet eftersom det finns starka bevis för att CLC-3 till och med CLC-7 fungerar som transportörer för 2Cl-/H+-utbyte, som i första hand befinner sig i intracellulära organeller, medan CLC-1, CLC-2, KA och KB är riktiga plasmamembrankloridledande jonkanaler5-9 . Eftersom den arketypiska CLC-egenskapen är utbytestransport och återfinns i alla former av cellulärt liv, kan den senare underklassen av proteiner, de äkta kloridkanalerna, därför betraktas som ”trasiga” kloridtransportörer, som har förlorat kopplingen mellan kloridtransport och förflyttning av en andra substratjon.

CLC-1

Denna grundare av CLC-familjen är den spänningsstyrda kloridkanalen i skelettmuskulaturen och tjänar till att reglera membranpotentialen och repolarisera membranet efter aktionspotentialer för att slappna av i muskeln. I de flesta vävnader skulle vi förvänta oss att kaliumkanaler skulle spela denna roll, vilket de gör i hjärt- och glattmuskulatur, samt att de reglerar membranens excitabilitet i andra celltyper. Det tvärgående tubulussystemet är en förlängning av plasmamembranet (sarkolemma) och tränger in i den kontraktila vävnaden. Det är avgörande för den snabba spridningen av elektrisk aktivitet i hela muskeln och iscensätter snabb och kontrollerad kontraktion. Kaliumutflöde från muskelcellerna till det begränsade utrymmet i t-tubuli skulle höja den extracellulära kaliumkoncentrationen och bryta ned jongradienten, vilket skulle leda till långvarig membrandepolarisering. Eftersom kloridkanaler spelar den dominerande repolariserande rollen förhindras detta. Funktionsförlustmutationer i CLC-1 leder till myotoni hos människor, getter och möss (för en nyligen publicerad översikt se10) och kännetecknas av försämrad muskelavslappning, vilket stämmer överens med förlusten av en repolariserande membranström.

Med ett uttryck som är begränsat till skelettmuskulaturen skulle CLC-1 kunna vara en attraktiv måltavla för läkemedel som kontrollerar muskelsammandragning genom att öka eller minska CLC-1-funktionen och därigenom minska respektive öka muskelexcitabiliteten. Föreningar som ökar CLC-1-funktionen skulle kunna behandla myotoni, särskilt i de fall då de skulle kunna kompensera för partiell förlust av kloridkanalaktivitet. Hämning av CLC-1 skulle kunna sänka tröskeln för muskelkontraktion och kan vara användbar vid muskelsvaghet eller degenerativa sjukdomar som muskeldystrofi.

CLC-2

Den inåtriktade kloridkanalen, CLC-2, har en något omfattande vävnadsdistribution. Den finns i centrala neuroner där den reglerar neuronal aktivitet11-13. I astrocyter regleras dess subcellulära inriktning på cellförbindelser av en interaktion med GlialCAM (MLC1), där mutationer stör denna inriktning och orsakar megalencefalisk leukoencefalopati14. Nya terapeutiska intressen inbegriper CLC-2 uttryck i tarmslemhinnan och lungbronkioler där den spelar en roll i tarm- respektive lungsekretet. Lubiprostone, ett läkemedel som används kliniskt för att lindra förstoppning, föreslogs utöva sin effekt genom att aktivera CLC-2, men denna effekt är kontroversiell. Medan denna förening aktiverar CLC-2-kanaler i vissa studier, reglerar den i andra studier CLC-2-trafikering och ökar CFTR-funktionen via aktivering av prostaglandinreceptorer15,16. Det finns dock fortfarande tillräckliga bevis för att en ökning av luftvägarnas CLC-2-funktion skulle kunna utgöra en alternativ kloridväg vid cystisk fibros17.

CLC-KA/KB

Dessa kloridkanaler uttrycks framför allt i njurepitel och bidrar till cellmembranens genomsläpplighet för passivt kloridflöde. De har en nyckelroll i nefronets uppstigande extremiteter och distala tubuli och tillhandahåller en basolateral väg för kloridreabsorption efter transport från primärurinen via det apikala membranet. CLCKB-genen, som kodar för CLC-KB, är en av fem gener som ligger till grund för Bartters syndrom. Funktionsförlustmutationer i CLC-KB resulterar i defekt kloridreabsorption och leder därmed till en saltförlustsjukdom som är associerad med polyuri. Ett av de viktigaste kännetecknen hos personer som är drabbade av CLC-KB-mutationer (Bartters typ III) är lågt blodtryck. En allvarligare form av sjukdomen orsakas av mutationer i BSND-genen (Bartters typ IV), som kodar för Barttin, ett accessoriskt protein som är viktigt för trafiken av både CLC-KA och KB till plasmamembranet18. Denna form av sjukdomen omfattar även sensorisk dövhet, som tros orsakas av förlust av trafikering av både CLC-KA och KB till epitelmembranen i innerörat. Förmodligen kan förlust av antingen CLC-KA- eller KB-aktivitet, men inte båda, tolereras av hörselsystemet. Detta tyder på att hämmare som är selektiva för antingen CLC-KA eller CLC-KB, eller partiell hämning av båda, kan fungera som ett nytt loopdiuretikum med potential att sänka blodtrycket och med få biverkningar. Detta har lett till studier av deras farmakologi och utveckling av nya inhibitorderivat med låg mikromolär affinitet19 , som hade diuretiska effekter när de administrerades till råttor20. Å andra sidan kan läkemedel som aktiverar CLC-KB-kanalerna öka den kvarvarande aktiviteten hos defekta kanaler hos Bartters typ III-patienter.

CLC-7

av underklassen 2Cl-/H+-utbytestransportörer är CLC-7 en lovande måltavla för läkemedelsverkan och dess hämning kan vara fördelaktig vid osteoporos. Återigen har denna indikation sitt ursprung i observationer av mänsklig sjukdom som orsakas av förlust av funktionsmutationer i CLC-7, som orsakar osteropetros21. Vid denna sjukdom är osteoklasternas benremodellering bristfällig, vilket tros orsakas av bristande syra- och enzymutsöndring. Detta leder till ett tätt ben som, om det reproduceras av en CLC-7-hämmare, skulle kunna minska upplösningen av benet och därmed stärka skelettet hos osteoporospatienter22,23. I proof-of-concept-studier har farmakologisk hämning av försurning24 eller störning av CLC-7-funktionen med antikroppar25 minskat benresorptionen. Hämning av CLC-7 kan dock inte vara utan komplikationer eftersom studier på människor och möss tyder på att bristande CLC-7-funktion också kan vara förknippad med neuronala lagrings- och degenerationsstörningar på grund av nedsatt lysosomal funktion26.

Mutationer med förlust av funktion hos människor – lärdomar från CFTR

Det är värt en kort paus i detta skede för att överväga att några av de terapeutiska indikationerna för nya CLC-målinriktade läkemedel syftar till att behandla sjukdomar som är distinkta och ligger i motsatt ände av spektrumet jämfört med dem som orsakas av defekt CLC-funktion. Förutom de sjukdomar som beskrivs ovan är Dents I-sjukdom en X-bunden njursjukdom som orsakas av förlust av CLC-5-funktionen (se27 för en nyligen publicerad översikt). Alla är sällsynta ärftliga sjukdomar och en viktig proteindefekt innebär antingen minskad proteinaktivitet eller trafikering till målmembranen. Faktum är att många enskilda mutationer orsakar ER-retention och bristande proteinmognad. En parallell skulle kunna göras med cystisk fibros, där de flesta av de drabbade individerna har den ER-hållande ΔF508-mutationen. Nya och stratifierade metoder för att behandla cystisk fibros har varit resultatet av en dubbel attack för att korrigera den muterade proteinveckningen (CF-korrigerare) och/eller öka aktiviteten hos plasmamembranets CFTR-kloridkanaler (CF-potentiatorer). Framgångar har nåtts med potentiatorklassen28 , som är effektiva hos patienter med mutationer som minskar CFTR-aktiviteten utan förlust av proteinbiosyntesen eller -trafiken (t.ex. G551D), men det återstår att fastställa hur effektiva veckningskorrigerare är (vilket krävs i majoriteten av fallen)29. Även om de sjukdomar som är förknippade med förlust av CLC-funktionen alla är sällsynta genetiska störningar kan vi kanske en dag behandla personer med myotoni, Bartters syndrom, Dents sjukdom och osteopetros samt cystisk fibros med läkemedel som korrigerar den egentliga orsaken till deras störning.

Kalciumaktiverade kloridkanaler

Slutligen kommer kalciumaktiverade kloridkanaler (ClCa-kanaler) att nämnas, som har klart definierade fysiologiska roller i ett antal celltyper, men vars molekylära identifiering har lidit av några falska och stapplande starter. Historien handlar om fyra typer av proteiner: medlemmar av genfamiljerna CLCA, Bestrophin, Tweety och TMEM16. I samtliga fall resulterade deras rekombinanta överexpression i generering av kloridströmmar i membranen som stimuleras av en höjning av den intracellulära kalciumkoncentrationen och, i varierande grad, av en depolarisering av membranen. Resan för CLCA tog slut när man fann att detta var ett protein som utsöndrades, men också sannolikt uppreglerade membranuttrycket av ClCa-kanaler som var endogena i uttryckssystemet30. Proteinerna Tweety och Bestrophin uppvisar inte alla de egenskaper hos ClCa-kanaler som studerats i större vävnader, även om Best1 verkar vara ansvarig för en del av ClCa i sensoriska neuroner31 och kan också vara en viktig regulator av kalciumfrisättning från det endoplasmatiska retikulumet32,33. Tre oberoende studier föreslog TMEM16A (även kallad Ano1) som en kandidat för en huvudkomponent, om än inte i sin helhet, för en kalciumaktiverad kloridkanal34-36. Många efterföljande studier, som underlättats av genereringen av molekylära verktyg, har stött detta. TMEM16A är viktig för att reglera membranens excitabilitet i vaskulär glatt muskulatur, är uppreglerad i en djurmodell av pulmonell hypertoni och tonen kan minskas genom kanalhämning37,38. I sensoriska neuroner kopplar TMEM16A närvaron av inflammatoriska mediatorer till membranens hyperexcitabilitet och TMEM16A-hämning har antinociceptiva effekter39. I djurmodeller av astma ökar uttrycket av denna speciella kloridkanal och dess hämning kan ha positiva effekter40. Den finns också i interstitiella celler av Cajal i tarmen och kanalens funktion krävs för den rytmiska sammandragningen av glatt muskulatur i tarmväggen41. Dessutom kan aktivering av TMEM16A utgöra en alternativ väg för epitelial kloridsekretion vid cystisk fibros42. Även om det fortfarande råder viss debatt om den exakta funktionen hos resten av TMEM16-familjen har ClCa-funktionen också tillskrivits TMEM16B (Ano2), som tros ligga till grund för ClCa-kanalen i olfaktoriska hårceller43,44. Det kan också finnas roller för denna klass av jonkanaler i cancercellsbiologi och dess hämning kan förhindra cellproliferation45-48.

Slutord

Denna översikt har belyst de olika rollerna för kloridledande eller -transporterande proteiner och hur deras dysfunktion är kopplad till sjukdom hos människor eller sjukdomsliknande symptom i djurmodeller. Det råder en allvarlig brist på farmakologiska reagenser som hämmar, aktiverar eller förbättrar membrantrafiken av kloridkanaler och transportörer. Framsteg görs när det gäller läkemedel som reverserar CFTR:s defekta funktion vid cystisk fibros, vilket förhoppningsvis kommer att resultera i läkemedel som är specifika för de olika typerna av ärftliga mutationer. Inhibitorer och aktivatorer av TMEM16A kalciumaktiverade kloridkanaler42,49 visar sig vara användbara laboratorieverktyg och nya föreningar kan bli effektiva läkemedel, särskilt om de kan ge vävnadsspecifika effekter. Molekyler som är specifika för särskilda CLC-kanaler är förmodligen de mest svårfångade. Genom att förstå den strukturella grunden för aktivering av spänningsstyrda CLC50 kan man identifiera proteindomäner som är målinriktade med hjälp av rationell strukturbaserad läkemedelsdesign. Sådana verktyg kommer att göra det möjligt för oss att testa några av de nya terapeutiska idéer som har granskats och presenterats här.

Författarens biografi

Dr Jon Lippiat disputerade på en doktorsavhandling om kaliumkanalers struktur, funktion och farmakologi vid University of Leicester. Han studerade pankreasbetacellernas funktion och diabetes vid University of Oxford innan han utnämndes till docent i farmakologi vid University of Leeds. Hans forskning handlar om att klarlägga de strukturella och fysiologiska egenskaperna hos flera olika typer av jonkanaler och transportörer och deras potentiella inriktning med nya farmakologiska reagenser.