Kolinbrist dämpar viktökning och förbättrar glukostolerans hos ob/ob-möss

Abstract

Förra studier har visat att kolintillgången är direkt kopplad till fetthaltsinducerad fetma och insulinresistens hos möss. Syftet med den här studien var att utvärdera om kolintillförsel även kan modulera fetma och insulinresistens orsakade av en genetisk defekt. Åtta veckor gamla manliga ob/ob-möss utfodrades i två månader med antingen kolinfattig eller kolintillförordnad kost. Vävnadsvikten, inklusive fettmassa och muskelmassa, bedömdes. Intracellulär signalering, glukagon och insulin i plasma samt glukos- och insulintoleranstest undersöktes också. Kolinfattig kost minskade kroppsvikttillväxten och minskade fettmassan. Kolinbrist minskade också plasmaglukosnivån och förbättrade glukos- och insulintoleransen även om fettlevern förvärrades. Ökad fettlipolytisk aktivitet, minskad plasmaglukagon och minskat uttryck av hepatisk glukagonreceptor observerades också med den kolinfattiga dieten. Våra resultat visar att en kolinfattig diet kan minska fettmassan och förbättra glukostoleransen hos överviktiga och diabetiska möss orsakade av en genetisk defekt.

1. Introduktion

Kolin är en viktig kostfaktor, som är involverad i vissa avgörande processer såsom biosyntesen av neurotransmittorn acetylkolin och den viktigaste membrankomponenten fosfatidylkolin (PC) . PC kan syntetiseras antingen genom CDP-kolinvägen eller via metylering av fosfatidyletanolamin med hjälp av fosfatidyletanolamin N-metyltransferas (PEMT). PEMT-vägen är endast kvantitativt betydelsefull i levern . Kolin är också en viktig prekursor till neurotransmittorn acetylkolin, som verkar via muskarin- och nikotinacetylkolinreceptorer. På senare år har en möjlig koppling mellan kolin och fetma/diabetes blivit uppenbar. Muskariniska acetylkolinreceptorer har föreslagits som en potentiell terapeutisk måltavla för fetma . Nyligen fann vi att PEMT-brist kunde skydda möss från fetthaltsinducerad fetma och insulinresistens. Detta skydd försvann dock när en hög dos kolin lades till den fettrika kosten . PEMT-vägen följt av PC-katabolism är den enda kända biosyntetiska vägen för kolin hos däggdjur . En betydande minskning av kolininnehållet i flera vävnader hittades hos PEMT-bristande möss (Li et al., opublicerade uppgifter), vilket ger en direkt koppling mellan kolin och fetthaltsinducerad fetma/insulinresistens. I den aktuella studien utfodrade vi ob/ob-möss med en kolinfattig (CD) diet för att utvärdera om kolinbrist också skulle kunna modulera genetiskt härledd fetma och insulinresistens.

2. Material och metoder

2.1. Djur och diet

Alla förfaranden godkändes av University of Alberta’s Institutional Animal Care Committee i enlighet med riktlinjerna från Canadian Council on Animal Care. 8 veckor gamla hanar ob/ob-möss från The Jackson Laboratory acklimatiserades i en vecka. Fem möss i varje grupp användes. Mössen hade fri tillgång till kolinfattig (CD) eller kolinförsedd (CS) kost i 2 månader. CD-dieten (MP Biomedicals Canada, katalognummer 901387) innehöll 20 % fett i form av ister. CS-dieten bestod av CD-dieten med 0,4 % (w/w) kolinklorid. Möss offrades genom bedövning med isofluran, följt av hjärtpunktion.

2.2. Kroppsviktsökning, mätning av muskelmassa och fettmassa

Kroppsvikten mättes varje vecka. Den magra massan och fettmassan analyserades, 2 månader efter att mössen satts på diet (premortem), med hjälp av EchoMRI-systemet.

2.3. Glukos- och insulintoleranstest

Glukostoleranstest: Efter 12 timmars fasta fick mössen en intraperitoneal injektion (i.p.) av 0,5 g dextros/kg kroppsvikt upplöst i steriliserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Insulintoleranstest: Efter 6 timmars fasta fick mössen i.p. en injektion av 1,0 enhet insulin (Sigma)/kg kroppsvikt i PBS. Blodglukoskoncentrationerna mättes med en glukometer i svansblod före och vid angivna tidpunkter efter injektionen.

2.4. Mätningar av mitokondriell komplex I/II-aktivitet

Aktiviteterna hos mitokondriella komplex I och II bestämdes med hjälp av mitokondriellt protein. För att isolera mitokondrieprotein förvarades proverna kortfattat på is och homogeniserades i en buffert som innehöll 75 mM sackaros, 225 mM sorbitol, 1 mM EGTA och 0,1 % fettsyrefritt bovint serumalbumin i 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Homogenatet centrifugerades vid 600× g i 15 minuter och den resulterande supernatanten centrifugerades ytterligare i 20 minuter vid 16 200 rpm. Mitokondrieproteinet i pelletsen suspenderades i en buffert som innehöll 20 mM Tris och 25 mM sackaros (pH 7,4) och förvarades vid -80 °C tills det används. Aktivitetsmätningen utfördes i en spektrofotometer under en period på 5 minuter som en minskning av absorbansen vid 600 nm till följd av reduktionen av 2,6-diklorfenol-indofenol (DCPIP) till ubikinon-1 i närvaro av antingen NADH (substrat för komplex I) eller succinat (substrat för komplex II) i enlighet med detta. Reaktionen genomfördes i närvaro av antimycin och kaliumcyanid som hämmare av komplex III och IV. Rotenon, som hämmare av komplex I, ingick också i reaktionsbufferten för komplex II-aktivitet.

2.5. Histologi och immunoblotting

För histologi dissekerades levern eller fettkuddarna i 10 % formaldehyd i PBS och följdes sedan av rutinmässig hematoxylin- och eosinfärgning. För immunoblotting, efter homogenisering och centrifugering vid 600× g av leverproverna, utsattes de resulterande supernatanterna för bestämning av proteinkoncentrationen (BioRad) för att säkerställa att lika stora mängder proteiner laddades till SDS-PAGE. Alla primära antikroppar mot hormonkänsligt lipas (fosfor-HSL/total HSL), fosforenolpyruvatkarboxykinas (PEPCK), acetyl-CoA-karboxylas (fosfor-ACC/total ACC) och AMP-aktiverat proteinkinas (fosfor-AMPK/total AMPK) är inköpta från Cell Signaling. Antikroppar mot pyruvatdehydrogenaskinas isoenzym 4 (PDK4), glukagonreceptor erhölls från Abcam, men suppressor of cytokine signalering 3 (SOCS3) och PGC-1α kom från Santa Cruz Biotechnology. tublin eller aktin användes som belastningskontroller för normalisering. Bilden analyserades med programmet ImageJ.

2.6. Plasmainsulin- och glukagonmätning

Mätningarna utfördes med hjälp av ett glukagon- och insulinanalys-kit för mus/råtta (Meso Scale Discovery) enligt företagets instruktioner.

2.7. Statistisk analys

Data visas som medelvärde ± SD. Skillnaderna bedömdes med hjälp av studentens t-test. Ett värde på 𝑃<0,05 ansågs vara signifikant.

3. Resultat

Cholinfattig kost bromsade signifikant kroppsviktsökningen upp till 2 månader (figur 1(a)) utan att påverka födointaget (dagligt födointag 7,21±1,23 g för CD-möss jämfört med 7,39±1,31 g för CS-möss, 𝑃>0,05). Det fanns en signifikant skillnad i startkroppsvikt mellan de två grupperna (30,42±1,70 g för CD-möss jämfört med 26,3±2,26 g för CS-möss, 𝑃=0,01). Kolinbrist påverkade inte vikten av hjärta, lever eller njurar (figur 1(b)), men det fanns en signifikant minskning av vikten av epididymalt och perirenalt fett (figur 1(c)). Ytterligare analyser med hjälp av magnetisk resonanstomografi visade att kolinbrist minskade fettmassan i hela kroppen och ökade den magra massan, oavsett om den uttrycks som absolut massa eller relativ procentuell andel av hela kroppsmassan (figur 1 d)). Kolinbrist ökade uttrycket av fettvävnadens fosfohormonkänsliga lipas, en aktiverad form av enzymet (figur 1(e)). Kolinbrist förändrade däremot inte fettvävnadens morfologi (figur 1(f)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 1

Kolin-bristfällig kost dämpar viktökning och ökar den fettlipolytiska kapaciteten. 8 veckor gamla hanar ob/ob-möss hade fri tillgång till antingen CD- eller CS-diet i 2 månader. Kroppsviktsökning (a), vävnadsvikt (b), vikt av epididymalt och perirenalt fett (c) samt fettmassa och muskelmassa (d) mättes. Proteinuttrycket av phospho- och totalhormonkänsligt lipas i fettvävnad analyserades genom immunoblotting (e). Fettkuddssektionerna färgades med H & E (f). ∗∗∗𝑃<0,01 och ∗𝑃<0,05 jämfört med CS-gruppen.

Bortsett från att påverka kroppsvikten minskade kolinbrist även fastande plasmaglukos (14,3±1,67 jämfört med 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) och glukagonnivån (figur 2 a)), även om det inte hade någon effekt på plasmainsulinnivån (figur 2 b)). En signifikant förbättrad glukos- och insulinintolerans observerades hos möss på kolinfattig diet (figurerna 2(c)-2(d)). För att undersöka den bakomliggande mekanismen analyserades de viktigaste enzymerna för glukosoxidation. Kolinbrist minskade det hepatiska proteinuttrycket av PDK4 (figur 3(a)), en negativ regulator av pyruvatdehydrogenasaktiviteten som kontrollerar inflödet av mitokondriellt acetyl-CoA, vilket tyder på ett förbättrat glukosutnyttjande. På samma sätt reducerades hepatisk PGC-1α (en välkänd uppströmsmodulator av PDK4) och PEPCK (ett nedströmsmål för PGC-1 α och ett nyckelenzym för glukoneogenes) (figur 3(b)), vilket tyder på en minskad glukoneogenes. Dessutom undersökte vi om den förbättrade glukos- och insulinintoleransen kunde förknippas med förändringen av leverinflammation och mitokondriell funktion. Varken proteinuttrycket av SOCS3 (figur 3(c)), en markör för proinflammation, eller aktiviteten hos mitokondriellt citratsyntas påverkades (data visas inte). Aktiviteten hos mitokondriellt komplex II, men inte komplex I, minskade dock signifikant vid kolinbrist (figur 3(d)). Av intresse är att proteinuttrycket av den hepatiska glukagonreceptorn också minskade vid kolinbrist (figur 3(e)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

(a)

(b)

.
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figur 3

Molekylära mekanismer som är involverade i förbättrad insulinkänslighet hos ob/ob-möss på kolin-bristfällig diet. 8 veckor gamla manliga ob/ob-möss hade fri tillgång till antingen CD- eller CS-diet i 2 månader. Hepatiskt proteinuttryck av PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c) och glukagonreceptor (e) analyserades genom immunoblotting. Aktiviteten hos mitokondriella komplex I och II mättes också (d). ∗𝑃<0,05 jämfört med CS-gruppen.

Trots förbättrad glukostolerans förvärrar kolinbrist fettlever, vilket stöds av histologisk analys och ökad hepatisk triglyceridmassa (figur 4(a)). För att förstå de mekanismer som ligger till grund för kolinbristinducerad fettlever undersökte vi de enzymer som är involverade i fettsyra β-oxidation och lipogenes. Kolinbrist ökade aktiviteten hos hepatiskt glycerol-3-fospho-acyltransferas (GPAT) (figur 4(b)) och minskade aktiviteten hos β-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenas (β-HAD) (figur 4(c)), ett nyckelenzym för fettsyra-β-oxidation, vilket tyder på att fler intracellulära fettsyror kanaliserades till lipidbiosyntes i stället för oxidation. Denna uppfattning stöddes ytterligare av en minskning av hepatiska phospho-AMPK- och phospho-ACC-uttryck (figur 4(d)), som sedan aktiverar ACC och ökar hepatisk lipogenes.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 4

Molekylära mekanismer som är involverade i utvecklingen av fettlever hos ob/ob möss på kolin-bristfällig diet. 8 veckor gamla hanar ob/ob-möss hade fri tillgång till antingen CD- eller CS-diet i 2 månader. Leversektionerna färgades med H & E-färgningsprotokollet, och mängden hepatisk triglycerid mättes (a). Aktiviteterna hos glycerol-3-fosfat-acyltransferas (GPAT) (b) och β-hydroxyl acyl-CoA dehydrogenas (β-HAD) (c) analyserades. Proteinuttrycket av phospho-AMPK och phospho-ACC övervakades (d). ∗𝑃<0,05 jämfört med CS-gruppen.

4. Diskussion

I tidigare arbeten har vi visat att kolintillskott är kopplat till fettrik kostinducerad fetma och insulinresistens hos PEMT-deficienta möss . Nyligen har vi funnit att kolininducerad insulinresistens är kolinspecifik, inte bara hos vildtypmöss utan även hos PEMT-bristande möss (Wu och Vance et al. opublicerade uppgifter). I den aktuella studien undersökte vi effekten av kolinbrist på ob/ob-möss. Vi påvisade fem nya effekter av kolinbrist: (1) ökad fettlipolytisk aktivitet; (2) förbättrad glukosoxidation; (3) minskad hepatisk fettsyraoxidation; (4) nedreglerat hepatisk glukagonreceptorexpression; (5) minskad hepatisk mitokondriell komplex II-aktivitet.

4.1. Kolinbrist dämpar viktökning

Kolinbrist dämpar signifikant fetthaltsinducerad fetma hos Pemt-/- möss och viktökning hos ob/ob-möss. Raubenheimer et al. rapporterade dock att kolinbrist inte påverkade viktökning eller vikten av fettvävnad . Skillnaden mellan två studier kan bero på skillnader i djurmodellerna och utfodringsprotokollen. I Raubenheimers studie utfodrades C57Bl/6-möss med antingen fettrik eller fettsnål kost i 8 veckor, men mössen fick endast CD- eller CS-diet under de sista 4 veckorna. Våra ob/ob-möss fick fettrik CD- eller CS-diet i 8 veckor. I litteraturen har både han- och honmöss ob/ob-möss använts flitigt i metaboliska studier, t.ex. av kroppsviktsökning och insulinkänslighet i lever (och muskler), och ingen signifikant könseffekt har rapporterats. I vår studie användes endast hanliga ob/ob-möss.

Vår nuvarande studie visar att kolin även kan modulera genetiskt härledd fetma. Eftersom kolinbrist inte påverkade matkonsumtionen kan ökad fettlipolytisk aktivitet (ökat uttryck av aktivt hormonkänsligt lipas) förklara minskad fettmassa och ökad kroppsvikt. Dessutom kan vi inte utesluta möjligheterna att kolinbrist kan öka energiförbrukningen eller uttrycket av UCP1 i brun fettvävnad och UCP2/UCP3 i skelettmuskulaturen, vilket är potentiella faktorer som bidrar till minskad viktökning .

4.2. Kolinbrist förbättrar glukostoleransen

I motsats till kolintillskott, som är kopplat till insulinresistens orsakad av fettrik kost hos möss , förbättrade kolinbrist glukostoleransen hos ob/ob-möss. Detta stämmer överens med Raubenheimers studie, där C57Bl/6-möss på en CD-högfettkost hade minskade insulinnivåer och förbättrad glukostolerans jämfört med kolintillskott av högfettkost . Hög plasmaglukagonhalt finns vanligen hos patienter med typ 2-diabetes . Kolininjektion ökade både plasmainsulin- och glukagonnivåerna hos råttor . Omvänt minskade kolinbrist i vår studie plasmaglukagon och minskade uttrycket av glukagonreceptorn. Eftersom glukagonreceptorantagonister på senare år har föreslagits som potentiella terapeutiska läkemedel för typ 2-diabetes , så kan det minskade proteinuttrycket av glukagonreceptorn hos ob/ob-möss på kolinbristdiet i viss mån förklara den förbättrade glukostoleransen. Det minskade uttrycket av PGC-1α i levern åtföljdes av en nedreglering av PEPCK och PDK4, vilket tyder på en minskad glukosproduktion och ökad glukosoxidation. Nedreglering av β-HADH-aktiviteten tydde på minskad fettsyraoxidation. Dessa processer åtföljdes av en minskad mitokondriell komplex II-aktivitet, vilket kan återspegla ett kompensatoriskt svar på minskad oxidativ stress i mitokondrierna. Således berodde CD-förbättrad glukostolerans på minskad hepatisk glukosproduktion och ökat glukosutnyttjande. Detta skulle kunna ske genom suppression av hepatisk glukagonreceptor, som reglerar AMPK via adenylatcyklas och därigenom modulerar PGC-1α och dess nedströmsmål, t.ex. PEPCK och PDK4, samt hepatisk mitokondriell elektrontransportkapacitet. Det krävs således ytterligare undersökningar för att bevisa om glukagonreceptorn kan vara ett nytt terapeutiskt mål för diabetes.

4.3. Kopplingen mellan fettlever och insulinresistens

Fettlever har visat sig vara en fetmaoberoende prediktor för typ 2-diabetes. Ökade intracellulära fettsyror tros spela en kausal roll för hepatisk insulinresistens . I den aktuella studien förvärrade kolinbrist fettlever, där en minskning av β-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenasaktiviteten och en ökning av glycerolpalmitoyl-acyltransferasaktiviteten observerades, vilket tyder på en roll för kolin i moduleringen av fettsyrametabolismen. Därför kan omdirigering av fettsyror till hepatisk triglyceridlagring vara en första skyddsmekanism för att sänka hepatiska intracellulära fettsyrekoncentrationer. Långvarig kolinbrist är dock kopplad till hepatosteatos, risk för neuralrörsdefekt samt risk för cancer och minnesförlust , vilket kan begränsa användningen av en kolinfattig diet som en långsiktig terapeutisk strategi för fetma och insulinresistens.

Slutsatsen är att kolinbrist kan förhindra viktuppgång och förbättra glukostoleransen hos ob/ob-möss. En måttlig begränsning av intag av livsmedel med högt kolininnehåll kan gynna fetma, prediabetiska och diabetiska patienter. Våra resultat föreslår nya möjliga terapeutiska tillvägagångssätt.

Abkortningar

PC:	Phosphatidylkolin
PEMT:	Phosphatidyletanolamin N-metyltransferas
CD:	Kolinbrist
CS:	Kolintillskott
HSL:	Hormonkänsligt lipas
PEPCK:	Phosphoenolpyruvatkarboxykinas
ACC:	Acetyl-CoA karboxylas
AMPK:	AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK)
PDK4:	Pyruvatdehydrogenaskinas isoenzym 4
SOCS3:	Suppressor av cytokinsignalering 3
GPAT:	Glycerol-3-fospho-acyltransferas.

Författarnas bidrag

G. Wu och L. Zhang bidrog i lika stor utsträckning.

Författarnas upplysningar

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag (MOP 89793) från Canadian Institutes of Health Research.