Förmågan att påvisa en korrelation mellan ett par biomolekyler förbättrades avsevärt av Erik Manders vid Amsterdams universitet, som introducerade Pearsons korrelationskoefficient för mikroskopister, tillsammans med andra koefficienter, av vilka ”överlappningskoefficienterna” M1 och M2 har visat sig vara de mest populära och användbara. Syftet med att använda koefficienter är att karakterisera graden av överlappning mellan bilder, vanligen två kanaler i en flerdimensionell mikroskopibildupptagning som registrerats vid olika emissionsvåglängder. Ett populärt tillvägagångssätt introducerades av Sylvain Costes, som använde Pearsons korrelationskoefficient som ett verktyg för att på ett objektivt sätt fastställa de tröskelvärden som krävs för M1 och M2. Costes tillvägagångssätt gör antagandet att endast positiva korrelationer är av intresse, och ger inte ett användbart mått på PCC.
Och även om användningen av koefficienter kan förbättra tillförlitligheten av kolokaliseringsdetektering avsevärt, beror det på ett antal faktorer, inklusive förhållandena för hur prover med fluorescens preparerades och hur bilder med kolokalisering förvärvades och bearbetades. Studier bör utföras med stor försiktighet och efter noggrann bakgrundsläsning. För närvarande är området behäftat med förvirring och ett standardiserat tillvägagångssätt har ännu inte fast etablerats. Försök att rätta till detta innefattar en ny undersökning och revidering av vissa koefficienter, tillämpning av en faktor för att korrigera för brus, ”Replicate based noise corrected correlations for accurate measurements of colocalization”. och förslag till ytterligare protokoll, som granskades grundligt av Bolte och Cordelieres (2006). På grund av fluorescensbildernas tendens att innehålla en viss mängd out-of-focus-signaler, samt poisson shot och annat brus, kräver de dessutom vanligtvis en förbehandling före kvantifiering. Noggrann bildrestaurering genom dekonvolution tar bort brus och ökar kontrasten i bilderna, vilket förbättrar kvaliteten på resultaten av kolokaliseringsanalysen. Hittills har de vanligaste metoderna för att kvantifiera kolokalisering beräknat den statistiska korrelationen mellan pixelintensiteterna i två olika mikroskopikanaler. Nyare studier har visat att detta kan leda till höga korrelationskoefficienter även för mål som är kända för att befinna sig i olika cellulära kompartment. En mer robust kvantifiering av kolokalisering kan uppnås genom att kombinera digital objektigenkänning, beräkning av områdets överlappning och kombination med ett korrelationsvärde för pixelintensitet. Detta ledde till begreppet en objektkorrigerad Pearsons korrelationskoefficient.