Rajskubs första roll var som Oompa-Loompa i en teateruppsättning av Willy Wonka & chokladfabriken, och hennes första huvudroll var Raggedy Ann. År 1996 medverkade hon i musikvideor för låtarna ”The Good Life” av Weezer och ”The New Pollution” av Beck.
Från 1996-1998 hade hon en återkommande roll i HBO-serien The Larry Sanders Show som bokningsassistenten Mary Lou Collins.
Hennes mest kända roll är CTU-systemanalytikern Chloe O’Brian i 24, som hon började med 2003 i början av seriens tredje säsong. Hennes karaktär blev en succé bland tittare och kritiker och var en av de få skådespelarna som återvände i seriens fjärde säsong. Efter att ha varit en vanlig gäststjärna i två säsonger blev Rajskub en huvudrollsinnehavare i seriens femte säsong. I slutet av serien var hon den kvinnliga huvudrollsinnehavaren, med topplacering näst efter Kiefer Sutherland. Hennes karaktär fick också äran att säga seriens sista ord i säsong 8:s seriefinal. Rajskub och Sutherland uppträdde kort som sina 24-karaktärer i ett avsnitt från 2007, ”24 Minutes”, av Fox animerade serie The Simpsons. I augusti 2013 tillkännagavs det att hon skulle återuppta sin roll som Chloe O’Brian i den begränsade serien 24: Live Another Day från 2014.
Rajskub var en av de ursprungliga skådespelarna i Mr Show. Hon medverkade i Kelsey Grammers The Sketch Show på Fox Television, The King of Queens som en karaktär vid namn Priscilla och i ett flertal filmer, bland annat Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama och Dude, Where’s My Car, Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, musikvideor för Beck, Weezer och Sheryl Crow, samt som porträtt av en blind kvinna i filmen Road Trip.
Rajskub var en del av en komisk duo (tillsammans med Karen Kilgariff) som heter Girls Guitar Club. År 2006 gjorde hon en cameo i ”Partings”, den sjätte säsongsfinalen av Gilmore Girls, där hon spelade en trobairitz som letar efter sitt stora genombrott. (Rajskub hade tidigare medverkat i Gilmore Girls som den kvinnliga huvudrollen i A Film by Kirk, en kortfilm gjord av karaktären Kirk Gleason). Hon har arbetat frivilligt som skådespelerska med Young Storytellers Program. Hon har en utbildningsbakgrund som målare och har gått på San Francisco Art Institute.
Rajskub har nominerats två gånger till en Screen Actors Guild Award; en gång 2005 och en gång 2007 för Outstanding Performance by a Ensemble in a Drama Series. Hon gästspelade i Flight of the Conchords avsnitt ”Prime Minister” som Karen, en Art Garfunkel-fanatiker. Hon gästspelade som ”Gail the Snail” i ett avsnitt av It’s Always Sunny in Philadelphia med titeln ”The Gang Gives Frank an Intervention”, och gjorde om rollen i finalen av den nionde säsongen, ”The Gang Squashes Their Beefs”, och i den trettonde säsongen ”The Gang Beats Boggs”: Ladies Reboot”. År 2009 medverkade hon även i filmen Julie & Julia som Sarah, en av Julie Powells nära vänner. År 2010 uppträdde Rajskub med stand-up i John Olivers New York Stand Up Show. I juni 2010 medverkade hon i avsnittet ”Lovesick” under den andra säsongen av USA-serien Royal Pains.
Från juli till oktober 2010 uppträdde hon i sin soloshow Mary Lynn Spreads Her Legs på Steve Allen Theater i Los Angeles. Recensenten F. Kathleen Foley från Los Angeles Times skrev ”den glatt vulgära titeln sammanfattar den övergripande tonen, som ofta är lätt obscen”. Föreställningen, som skrevs av Rajskub med hjälp av regissören/utvecklaren Amit Itelman, inspirerades av Rajskubs erfarenheter av graviditet, förlossning och tidigt moderskap.
I januari 2011 gästspelade Rajskub i avsnittet ”Our Children, Ourselves” i den andra säsongen av ABC:s Modern Family. Hösten 2011 medverkade Rajskub i den kortlivade sitcomen How to Be a Gentleman. Under 2011 började Rajskubs webbserie Dicki sändas på My Damn Channel. Dicki är baserad på ett antal personer som Rajskub växte upp inom och runt Michigan. Titelfiguren är en 40-årig kvinna som bor hemma hos sina föräldrar, gör hantverk och tar sin konst på allvar. Dicki har varit en av My Damn Channels mest framgångsrika webbserier hittills. Den första säsongen avslutades i november 2011, men en andra säsong är för närvarande under utveckling. Rajskub medverkade i juni 2012 års upplaga av Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), en månatlig showcase där kändisar delar med sig av sanna historier som de aldrig skulle vilja att deras mammor skulle få veta. Hon är för närvarande värd för en podcast på Nerdist Network som heter Kickin’ it Mary Lynn Style.
2013 medverkade Rajskub i den fjärde säsongen av Arrested Development i en tyst men väl mottagen roll som Heartfire, en karaktär som Rajskub har sagt ”talar från hjärtat, men använder inga ord”. Samma år medverkade Rajskub även i webbserien All Growz Up med Melinda Hill.
Rajskub medverkade i Ken Reids podcast TV Guidance Counselor den 27 mars 2015.
I augusti 2016 uppträdde Rajskub på Edinburgh Festival Fringe i 24 Hours With Mary Lynn Rajskub och den togs emot väl av fans och kritiker.
År 2017 medverkade Rajskub i den första säsongen av Adult Swim-serien Dream Corp LLC, där hon spelade Patient 46 i avsnittet ”Are You Down With OCD?”.
Under 2018 medverkade Rajskub i Night School mittemot Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe och Keith David.
Under 2021 släppte Rajskub en 49 minuter lång komedispecial kallad Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; den kan hyras eller köpas via flera video-on-demand-tjänster.