Av de DNA-fragment som vi inledningsvis försökte amplifiera, var det endast tlp2, che1P och cheA1 (tabell 1) som producerade en PCR-amplifieringsprodukt utan användning av lösningsmedelstillsatser, när genomiskt DNA från A. brasilense användes som mall (figur 1). Först testades effekterna av DMSO på 1,25 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 % och 10 % (w/vol) samt formamid i liknande koncentrationer som tillsatser i PCR (figur 1). En uppsättning PCR kördes också med BSA på 1-10 μg/μl (data visas inte). I överensstämmelse med uppgifter från litteraturen ökade både DMSO- och formamidtillsats i PCR det ökade utbytet av amplifiering av DNA-fragment på 2-3 kb, men den förstärkande effekten av DMSO var större än den av formamid (figur 1). Under dessa förhållanden observerade vi också att en ökad koncentration av DMSO också kunde leda till minskad PCR-specificitet (figur 2). Å andra sidan minskade effekten av formamid för att främja ett ökat PCR-utbyte för DNA-fragment som var större än cirka 2,5 kb (figur 1). Det fanns ingen signifikant effekt av att tillsätta enbart BSA som PCR-tillsats under dessa förhållanden, inklusive ingen skadlig effekt (Data not shown). BSA:s förstärkande effekter på PCR-utbytet upptäcktes när den användes i kombination med DMSO eller formamid, över ett brett spektrum av DNA-fragmentens storlek (figur 2). Dessutom breddade tillsatsen av BSA intervallet av koncentrationer för vilka det organiska lösningsmedlet kunde tillsättas, även för DNA-mallar av större storlek (figur 2). Den aktuella litteraturen om formamid visar att den är mest effektiv som PCR-tillsats när den används i koncentrationer mellan 0 och 5 %, och att effektiviteten avtar helt vid 10 %. Våra resultat visar att formamid i närvaro av BSA är effektivt åtminstone upp till koncentrationer på 10 % och med DNA-mallar med en storlek på upp till 2,5 kb (tlp2), men att det inte främjade amplifiering av DNA-fragment av större storlek (figur 1). Detta resultat stämmer överens med den rapporterade effekten av formamid som mest effektiv för amplifiering av DNA-mallar upp till cirka 2,5 kb och stöder ytterligare tanken att DMSO och formamid förbättrade PCR-utbytet genom olika mekanismer. Oavsett dessa skillnader verkade tillägget av BSA till denna PCR ytterligare främja och utvidga de gynnsamma effekter som sågs när något av de två lösningsmedlen användes som PCR-tillsats. Med tanke på de potentiella negativa effekter som höga koncentrationer av organiska lösningsmedel kan ha på känsliga tillämpningar i efterföljande led, t.ex. sekvensering eller kloning, är den förstärkande effekten av BSA-tillsatsen betydande. För att få en inblick i hur BSA kan fungera som en samförstärkare tillsammans med DMSO eller formamid analyserar vi effekten av tillsats av BSA på amplifieringsutbytet under 10, 15, 20, 25 och 30 PCR-cykler. Denna analys bekräftade att tillsats av DMSO eller formamid, men inte enbart BSA, till PCR leder till en ökning av utbytet (figur 3). När BSA användes som en samförstärkare tillsammans med DMSO eller formamid kunde en ökning av utbytet upptäckas endast under de första 15 cyklerna för alla mallar (figur 3). Denna ökning varierade från en ökning av utbytet med 10,5 % (che1P) till en ökning av utbytet med 22,7 % (cheA1) under de första 15 cyklerna. Den effektiva koncentrationen av BSA visade sig dessutom öka med storleken på det amplifierade DNA-fragmentet upp till en maximal BSA-koncentration (10 μg/μl) där ingen ytterligare ökning av utbytet upptäcktes. Dessutom observerades ingen minskning av utbytet ens med den högsta koncentrationen av BSA som tillsattes under dessa förhållanden (figur 4). Den cykelbegränsade ökande effekten av BSA på PCR-utbytet tyder på att detta protein kan denatureras med tiden och därmed förlora sin effektivitet. För att testa denna hypotes sattes en PCR upp där DMSO eller formamid kombinerades med BSA i den inledande reaktionsbufferten i de mest effektiva koncentrationer som fastställts ovan, och kördes i 10 cykler innan en ny lösning av BSA (0-10 μg/μl slutlig koncentration) tillsattes. Tillsättningen av BSA upprepades under 30 PCR-cykler och effekten på utbytet analyserades enligt beskrivningen ovan. En varaktig ökning av utbytet kunde påvisas när BSA tillsattes vid var tionde PCR-cykel: vid amplifiering av cheA1 erhölls t.ex. en ökning av PCR-utbytet med nästan 75 % jämfört med den som erhölls med enbart lösningsmedel (figur 4). De resultat som observerades i det som vi kallar ”BSA PCR-steget” är förenliga med antagandet att denatureringen av BSA orsakar minskningen av den avkastningshöjande effekten efter den femtonde PCR-cykeln. Kontrollförsök där glycerol eller destillerat sterilt vatten tillsattes vid var tionde cykel ökade inte PCR-utbytet, vilket tyder på att effekterna av BSA inte beror på en förändring av reaktionsvolymen eller på att BSA effektivt agerar som en molekylär trängselfaktor, en egenskap som tillskrivs en del av effekterna av glycerol i PCR . Även om de exakta mekanismerna för BSA:s förstärkande effekt på PCR-utbytet inte är kända, stöder de uppgifter som erhållits här och som beskrivs i litteraturen hypotesen att BSA kan stabilisera DNA-polymeraset och/eller motverka de potentiellt hämmande effekterna av höga koncentrationer av organiska lösningsmedel på DNA-polymerasaktiviteten. För amplifiering av cheA4, det DNA-fragment med det högsta GC-innehållet som användes i den här studien (73 %), erhölls en ökning av PCR-utbytet genom att tillsätta både BSA och DMSO till PCR, men flera ospecifika amplifieringsprodukter upptäcktes också (figur 5). För att lösa detta problem användes PCR-stegsmetoden med BSA i kombination med ett PCR-protokoll med ”Touchdown” som tidigare har visat sig förbättra PCR-specificiteten . Denna metod gav ett enda specifikt band och fördubblade nästan det utbyte som producerades genom att enbart använda ”Touchdown”-protokollet och organiska lösningsmedel (96 % ökning) (figur 5). Dessa resultat föreslog också för oss ett sätt att förbättra den relativt låga effektiviteten av att använda metoden för platsstyrd mutagenes av hela plasmiden som beskrivs i QuickChange Stratagene Mutagenesis Kit (Stratagene) för att införa mutationer i någon GC-rik DNA-mall (här tlp2-genen, ett 2,5 kb-fragment med 66 % GC). När vi använde pUCtlp2 som mall för site-directed mutagenesis, tillsammans med mutagena primers utformade för att introducera ett enda baspars substitution inom tlp2 (mutagena primers utformade enligt tillverkarens webbplats) och tillverkarens protokoll, var det 5,324 kb-fragment som motsvarar pUCtlp2 knappt synligt (figur 5). Efter att ha slutfört mutagenesprotokollet enligt tillverkarens anvisningar erhölls antingen ingen koloni eller ett litet antal kolonier (i genomsnitt mindre än 5) som innehöll föräldraplasmider som saknade den önskade mutationen. Denna typ av resultat, som kännetecknas av ett dåligt utbyte av mutagenes, har tidigare erkänts som en vanlig fallgrop för denna metod . När BSA kompletterades med tillverkningens buffert vid vart femte steg upptäcktes dock en tydlig amplifieringsprodukt (figur 5). När tillverkarens protokoll hade slutförts erhölls över 100 kolonier med 2/3 som bar den önskade mutationen (bestämd genom sekvensering). Vi tillämpade också BSA PCR-steget i ett överlappande förlängningsprotokoll för att konstruera en chimär proteinfusion mellan en A. brasilense-gen (ATM, 650 bp) och det cyanfluorescerande proteinet (CFP) (720 bp). I PCR-processen med överlappande förlängning används först två uppsättningar primerpar för att amplifiera två DNA-fragment som ska fusioneras och som produceras med en kort överlappande sekvens med varandra. I en tredje amplifiering används amplifieringsprodukterna från de första reaktionerna som mallar tillsammans med de yttersta omvända och framåtriktade primrarna för att generera chimära konstruktioner . Amplifieringen av de två första DNA-fragmenten, ATM och CFP, var mycket effektiv med hjälp av vanliga PCR-protokoll och ingen signifikant ökning kunde erhållas genom att använda BSA PCR Step-protokollet (Data not shown). Det andra, överlappande PCR-steget gav dock upphov till många ospecifika amplifieringsprodukter och lite, om ens någon, önskad chimär amplikon (ATM-CFP; tabell 1) (figur 5). De ospecifika amplifieringsprodukterna försvann när man använde en ”Touchdown”-PCR-metod, men den specifika önskade chimära amplikonen förblev i mycket liten mängd, vilket påvisades genom ett mycket svagt ATM-CFP-band på 1 370 bp (figur 5). Användning av BSA PCR Step-metoden tillsammans med ett ”Touchdown”-protokoll resulterade i en 72-procentig ökning av utbytet av den chimära ATM-CFP-amplikonen (figur 5). Efterföljande kloning och sekvensering bekräftade att den korrekta chimära konstruktionen har erhållits.
Effekter av DMSO och formamid på PCR-amplifiering av GC-rika mallar. Typiska exempel på effekterna av tillsats av DMSO och formamid i olika koncentrationer på PCR-amplifieringen av GC-rika DNA-mallar på 2-3 kb. A) Effekten av DMSO på PCR-amplifiering av che1P (överst) och tlp2 (nederst) som observerats genom gelelektrofores av totala PCR-produkter. Gelerna färgades med etidiumbromid och fotograferades. B) Effekten av formamid på PCR-amplifiering av che1P (överst) och tlp2 (nederst) i jämförbara experiment.
PCR-utbytesförstärkande effekt av BSA som används som ett co-additiv med organiska lösningsmedel. Typiska exempel på effekterna av BSA som tillsatsmedel tillsammans med DMSO och formamid, i olika koncentrationer, på PCR-amplifiering av GC-rika DNA-mallar. A) Effekt av DMSO på PCR av che1P (vänster) och kombinerad effekt av DMSO med 6 μg/μl BSA (höger) som observerats genom gelelektrofores av total PCR-produkt. B) Effekter av formamid på PCR-amplifiering av che1P (vänster) och kombinerad effekt av formamid med 6 μg/μl BSA (höger) i jämförbara experiment.
Effekten av BSA-tillsats som en samförstärkare med organiska lösningsmedel på PCR-avkastning. Ökningen av PCR-avkastningen uttrycks i förhållande till den PCR-avkastning som erhållits utan någon tillsats. På alla paneler gäller följande legend: röd linje, endast DMSO (7,5 %); grön linje, endast formamid (2,5 %); lila linje, DMSO (7,5 %) och BSA (6 μg/μl); ljusblå, formamid (2,5 %) och BSA (6 μg/μl). A) PCR-amplifiering av che1P (392 bp), B) PCR-amplifiering av tlp5P (798 bp), C) PCR-amplifiering av tlp2 (2 638 bp), D). PCR-amplifiering av cheA1 (3 389 bp); E) PCR-amplifiering av cheOP1 (7 103 bp).
Effekten av BSA som ett co-additiv till organiska lösningsmedel när det kompletteras i mellanstadier av PCR. A) Effekten av BSA-tillsats på PCR-utbytet när den tillsätts var tionde cykel för DNA-fragment med ett brett storleksintervall (392 bp till 7 103 bp). B) Representativt exempel på effekten av BSA-tillsats på PCR-amplifieringen av cheA1 (3 389 bp) i närvaro av DMSO, vilket påvisas genom analys av DNA-fragment som amplifierats genom gelelektrofores.
Effekt av BSA som ett co-additiv med organiska lösningsmedel i olika PCR-applikationer. A) Ett representativt exempel på effekten av BSA-tillsats (BSA-steg) som en samförstärkare av DMSO-effekten på PCR-amplifiering av cheA4 i ett PCR-protokoll av typen ”Touchdown”, vilket påvisas genom gelelektrofores. B) Ett representativt exempel på effekten av BSA Step-protokollet som används vid site-directed mutagenesis (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene) PCR-amplifiering av pUCtlp2, som detekteras genom gelelektrofores. C) Ett representativt exempel på effekten av BSA Step-protokollet som används i en PCR-applikation med överlappande förlängning, där ATM fusioneras med CFP för att ge ATM-CFP, som detekteras genom gelelektrofores.