4.3. Nikotinreceptorns struktur
Nikotinreceptorn i det elektriska organet och ryggradsdjurens skelettmuskulatur är en pentamer som består av fyra distinkta underenheter (a, b, g och d) i det stökiometriska förhållandet 2:1:1:1:1, respektive. I mogna, nerverade muskeländplattor ersätts g-underenheten av e, en närbesläktad underenhet. De enskilda subenheterna är ungefär 40 % identiska i sina aminosyresekvenser och härstammar från en gemensam urgener. Nikotinreceptorn blev prototyp för andra pentameriska ligandstyrda jonkanaler, däribland receptorerna för de hämmande aminosyrorna (g-aminosmörsyra och glycin) och vissa serotoninreceptorer (5-HT3). Var och en av underenheterna i den pentameriska receptorn har en molekylmassa på 40 000 till 60 000 dalton. De aminoterminala 210 resterna utgör praktiskt taget hela den extracellulära domänen. Denna följs av fyra transmembranöverskridande (TM) domäner; regionen mellan den tredje och fjärde domänen utgör större delen av den cytoplasmatiska komponenten. Var och en av underenheterna i den nikotiniska ACh-receptorn har en extracellulär och en intracellulär exponering på det postsynaptiska membranet. De fem subenheterna är arrangerade runt en pseudosymmetrisk symmetriaxel för att omskriva en internt belägen kanal.
Receptorn är en asymmetrisk molekyl (14 nm×8 nm) på 250 000 dalton, med huvuddelen av den icke-membranöverskridande domänen på den extracellulära ytan. I korsningsområden (dvs. den motoriska ändplattan i skelettmuskulaturen och den ventrala ytan av det elektriska organet) finns receptorn i höga tätheter (10 000/mm2) i en regelbunden packningsordning. Denna ordning av receptorerna har möjliggjort en elektronmikroskopisk bildrekonstruktion av dess molekylära struktur. Ett AC-bindande protein som endast är homologt med den extracellulära domänen av nikotinreceptorn har identifierats i söt- och saltvattensnäckor och karakteriserats strukturellt och farmakologiskt.
Detta protein samlas som en homomerisk pentamer och binder nikotinreceptorns ligander med förväntad selektivitet; dess kristallstruktur avslöjar en atomär organisering som förväntas av nikotinreceptorn. Dessutom ger fusionen av det ACh-bindande proteinet och receptorns transmembransträckor ett funktionellt protein som uppvisar den kanalutgång och de tillståndsförändringar som förväntas av receptorn. Detta bindningsprotein fungerar både som ett strukturellt och funktionellt surrogat för receptorn och har gett en detaljerad förståelse för de faktorer som styr nikotinreceptorns ligandspecificitet. De agonistbindande platserna finns vid underenheternas gränsytor, men i muskeln har endast två av de fem underenheternas gränsytor, a g och a d, utvecklats för att binda ligander. Bindningen av agonister, reversibla kompetitiva antagonister och elapid a-toxinet utesluter varandra och involverar överlappande ytor på receptorn. Båda de underenheter som bildar gränssnittet mellan underenheterna bidrar till ligandspecificiteten. Mätningar av membranens konduktans visar att jontranslokationen är tillräckligt snabb (5×107 joner per sekund) för att kräva jontranslokation genom en öppen kanal snarare än genom en roterande jonbärare. Dessutom sker agonistmedierade förändringar av jonpermeabiliteten (vanligtvis en inåtriktad rörelse av i första hand Na+ och i andra hand Ca2+) genom en katjonkanal som är inneboende i receptorns struktur. Den andra transmembranöverskridande regionen på var och en av de fem underenheterna utgör kanalens inre omkrets. I muskelreceptorn leder samtidig bindning av två agonistmolekyler till en snabb konformationsförändring som öppnar kanalen. Både bindnings- och öppningsresponsen uppvisar positiv kooperativitet. Detaljer om kinetiken för kanalöppning har utvecklats från elektrofysiologiska patch-clamp-tekniker som särskiljer de enskilda öppnings- och stängningshändelserna för en enskild receptormolekyl och bekräftar att nikotiniska acetylkolinreceptorer (nAChR) är pentameriska ligandstyrda jonkanaler som består av subenheter som består av en extracellulär domän som bär den ligandbindande platsen och en distinkt jonporedomän. Signaltransduktionen är resultatet av den allosteriska kopplingen mellan de två domänerna. Avståndet från bindningsstället till poredomänens grind är 50 Å. Studier av receptorbindning är dock specifika för nikotiniska kolinerga receptorer och har utförts på isolerade vestibulära epitelceller från grodorna Rana catesbiana och Rana temporaria. Bevis läggs fram för förekomsten av nikotinliknande kolinerga receptorer som är specifikt knutna till de sensoriska områdena, och man har studerat bindningen av atypiska nikotinagonistkonformationer som ger subtypselektivitet och drar slutsatsen att nAChR har en avgörande roll i excitatorisk neurotransmission och är en viktig måltavla för läkemedel och insektsbekämpningsmedel. Olika nAChR-subtyper med olika kombinationer av subenheter som ger differentiell selektivitet för nikotinläkemedel, och identifierade också en familj av gener som kodar för proteiner som är homologa med α-subenheten av muskelns nikotiniska acetylkolinreceptor i råttans arvsmassa. Dessa gener transkriberas i det centrala och perifera nervsystemet i områden som man vet innehåller funktionella nikotinreceptorer. Den roll som β2-innehållande neuronala nikotinreceptorer (nAChR) spelar när det gäller att förmedla nikotins biverkningar hos fostret och det nyfödda barnet. Gravida WT- och muterade möss som saknar β2 nAChR-underenhet implanterades med osmotiska minipumpar som levererade antingen vatten eller en kontrollerad dos nikotin. Därefter jämfördes utvecklingen av det sympato-adrenala systemet och andnings- och väckningsreflexer hos avkomman strax efter födseln, en period av ökad sårbarhet för nikotinexponering. Å andra sidan är neonikotinoider, som imidakloprid, nAChR-agonister med potent insekticidaktivitet. Sedan imidakloprid introducerades i början av 1990-talet har det blivit ett av de mest använda insekticiderna för både växtskydd och djurhälsa, den molekylära grunden för imidaklopridresistens, fem nAChR-underenheter (Nlα1-Nlα4 och Nlβ1) har klonats från Nilaparvata lugens. En jämförelse av generna för nAChR-underenheter från imidaklopridkänsliga och imidaklopridresistenta populationer har identifierat en enda punktmutation på en bevarad position (Y151S) i två nAChR-underenheter, Nlα1 och Nlα3. En stark korrelation mellan frekvensen av punktmutationen Y151S och graden av resistens mot imidakloprid har påvisats genom allelspecifik PCR. Genom att uttrycka hybrida nAChRs som innehåller Nilaparvata lugens α- och råttans β2-underenheter har bevis erhållits som visar att mutationen Y151S är ansvarig för en väsentlig minskning av den specifika bindningen till imidakloprid. Denna studie ger direkta bevis för förekomsten av målplatsresistens mot en neonikotinoid insekticid, och undersökte om karaktären av katjon-π-bindningsstället i den nikotiniska receptorn och finner att den nikotiniska acetylkolinreceptorn är prototypen av en ligandstyrd jonkanal. Ett antal aromatiska aminosyror har identifierats som bidragande till agonistbindningsstället, vilket tyder på att katjon-π-interaktioner kan vara inblandade i bindningen av den kvartära ammoniumgruppen i agonisten acetylkolin. Konformationen av kolinerga molekyler vid nikotiniska nervreceptorer och finner en korrelation mellan kristallstrukturanalyserna av de potenta nikotiniska agonisterna acetylkolin, acetyl-α-metylkolin, laktoylkolin, 1,1-dimetyl-4-fenylpiperazin och nikotin gör det möjligt att bestämma konformationen av kolinerga agonister som är relevanta för nikotiniska nervreceptorer. Uttrycket av neurotransmittoreceptorer som kodas av mRNA som isolerats från tre humana gliomcellinjer. Oocyter som injicerats med mRNA från två glioblastomcellinjer uppvisade inga elektriska reaktioner på de olika testade neurotransmittorerna.
Modulering av nAChR med stryknin finner att stryknin är en potent och selektiv antagonist vid glycinreceptorer som visade sig hämma muskelreceptorer (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ och α 1β 1δ) och neuronala (α 2β 2 och α 2β 4) nikotiniska acetylkolinreceptorer (AcChoR) som uttrycks i Xenopus oocyter. Enbart stryknin (upp till 500 µmol/L) framkallade inte membranströmmar i oocyter som uttrycker AcChoRs, men när det applicerades före, samtidigt eller under superfusion av acetylkolin (AcCho) hämmade det snabbt och reversibelt den ström som framkallades av AcCho (AcCho-ström). Översättning av exogent messenger RNA som kodar för nAChRs producerar funktionella receptorer i Xenopus oocyter, i denna studie injicerades messenger RNA som extraherats från Torpedos elektriska organ i Xenopus oocyter. Detta ledde till att funktionella acetylkolinreceptorer syntetiserades och införlivades i oocytens membran. När de aktiverades av acetylkolin öppnade dessa Torpedo-acetylkolinreceptorer i oocytens membran kanaler vars joniska permeabilitet liknade nikotinreceptorernas i andra celler.
Lokaliseringen av acetylkolinreceptorer (AChR) på ytan av utvecklande myogena celler i kycklingembryots främre och bakre latissimus dorsi-muskel i förhållande till innervationsprocessen har studerats på ultrastrukturell nivå med hjälp av ett pepparrotsperoxidas-α-bungarotoxin-konjugat. Lokaliserade koncentrationer av AChR hittades i små områden 0,1-0.4 µm på ytan av myogena celler i 10-14 dagar gamla muskler, och även studerade effekter av acetylkolin och medel som efterliknar eller blockerar dess fysiologiska verkan har studerats på koncentrationer av guanosin 3′:5′-cykliskt monofosfat (cykliskt GMP) och adenosin 3′:5′-cykliskt monofosfat (cykliskt AMP) i skivor av däggdjurs hjärnbark, hjärtkammare och ileum. Acetylkolin och kolinomimetiska medel med huvudsakligen muskarinisk verkan, t.ex. metakolin, betanekol och pilokarpin, framkallade en ökning av koncentrationen av cykliskt GMP eller en liten minskning av koncentrationen av cykliskt AMP i alla tre undersökta vävnader.
De funktionella egenskaperna och den cellulära lokaliseringen av den humana neuronala α7 AcCho-receptorn (α7 AcChoR) och dess L248T-muterade (mut) form undersöktes genom att uttrycka dem ensamma eller som genfusioner med den förstärkta versionen av grönt fluorescerande protein (GFP). Xenopus oocyter som injicerats med cDNA:er av vildtyp, mutα7 eller den chimära underenheten uttryckte receptorer som utlöste membranströmmar när de exponerades för AcCho. Som redan är känt avtar AcCho-strömmar som genereras av wtα7-receptorer mycket snabbare än de som framkallas av mutα7-receptorer. Samspelet mellan β2 nikotinreceptorer och dopaminvägar i kontrollen av spontan rörelse och finner att acetylkolin (ACh) är en känd regulator av aktiviteten hos dopaminerga (DAergic) neuroner genom stimulering av nAChRs. Men underenhetssammansättningen och den specifika placeringen av nAChRs som är involverade i DA-medierad rörelseförmåga har ännu inte fastställts in vivo. Möss som saknar β2-underenhet av nAChRs (β2KO) uppvisar påfallande hyperaktivitet i det öppna fältet, vilket tyder på en obalans i DA-neurotransmissionen. Mutation inom domän M2 av nikotinreceptorn omvandlar dock 5-hydroxytryptamin från antagonist till agonist, studien gjordes på effekterna av 5-hydroxytryptamin (5HT) på homomeriska neuronala nikotinreceptorer (nAcChoR) som uttrycks i Xenopus oocyter efter injektion av cDNA som kodar för kycklingens underenhet av vildtyp. AcCho framkallade stora strömmar som reducerades av 5HT på ett reversibelt och dosberoende sätt, med en halvhämmande koncentration och en Hillkoefficient. Även om studier av den kolinerga receptorn hos cytotoxiska T-lymfocyter och kolinerga agonister har sensibiliserade lymfocyters förmåga att skada celler som bär på de sensibiliserande alloantigenerna har den kolinerga receptorn hos den angripande lymfocytpopulationen studerats med farmakologisk manipulation av ett in vitro-system som kvantifierar den skada som förmedlas av sensibiliserade angripande celler på målceller.