Diskussion
Ett av de allvarligaste problemen i samband med behandling av infektioner orsakade av C. striatum är isoleringen av multiresistenta stammar från kliniskt material och valet av lämplig antibiotikabehandling för en viss typ av infektion. C. striatum-infektioner bör behandlas i enlighet med resultaten av känslighetstesterna. Multipel läkemedelsresistens orsakas av samspelet mellan flera resistensmekanismer som uppstår genom förvärv av främmande resistensdeterminanter eller spontana mutationer. Detta arbete belyser den höga prevalensen av multiresistenta stammar och resistensgener bland C. striatum som isolerats på ett sjukhus i Tunisien, särskilt resistens mot aminoglykosider, föreningar från MLSB-gruppen, fluorokinoloner och β-laktamer.
De 63 C. striatum som analyserades i denna studie var mottagliga för vankomycin och linezolid. I en tidigare rapport där man använde diskdiffusionsmetoden visade Martinez et al.19 att 31 C. striatum isolerade från kliniska prover var mottagliga för vankomycin. Nyligen rapporterade Gomila et al.20 att deras 52 C. striatum som isolerats från patienter med kronisk obstruktiv respiratorisk sjukdom också var mottagliga för vankomycin. Vancomycin är fortfarande verksamt i dag och utgör därför ett lämpligt alternativ för behandling av allvarliga infektioner orsakade av C. striatum. Linezolid har också visat en utmärkt aktivitet, med MIC-värden som rutinmässigt ligger under 0,5 mg/L21. Gómez-Garcés et al.22 visade att vankomycin och linezolid var lika aktiva mot 30 kliniska C. striatum (MICs90 för båda föreningarna = 0,5 mg/L). Linezolid kan betraktas som ett alternativ till vankomycin mot C. striatum, även om dess biverkningar under de långa behandlingskurser som krävs för hårdvaru- eller apparatassocierade infektioner måste övervägas. Alla våra C. striatum var mottagliga för daptomycin (MIC90 = 0,25 mg/L). Daptomycin har också visat sig vara aktivt mot C. striatum, ensamt23 eller i kombination med rifampicin24. Därför kan daptomycin också betraktas som ett alternativ till vankomycin för behandling av C. striatum-infektioner, även om snabb uppkomst av höggradig daptomycinresistens nyligen har rapporterats25, 26.
Aminoglykosider används som kompletterande antibiotika för att behandla allvarliga infektioner orsakade av difteroider. Bland aminoglykosiderna visade amikacin och gentamicin god aktivitet ”in vitro” mot vår C. striatum (MICs90 = 1 respektive 2 mg/L). Aminoglykosidresistens uppstår genom flera mekanismer som kan samexistera samtidigt i samma cell. Enzymatisk inaktivering av antibiotikamolekylen är den vanligaste i den kliniska miljön. Genen aac(3)-XI, som kodar för ett aminoglykosid 3-N acetyltransferas som ger resistens mot gentamicin och tobramycin i C. striatum27 , hittades inte i våra tre gentamicinresistenta isolat, vilket tyder på att resistensen förmedlas av en annan mekanism. Kanamycin och streptomycin används inte i klinisk praxis i Tunisien men testades i denna studie eftersom de är bra markörer för att upptäcka förekomsten av aph(3′)-Ic-, aph(3″)-Ib- och aph(6)-Id-generna. aph(3′)-Ic-genen, som kodar för ett aminoglykosid-O-fosfototransferas som är inblandat i resistens mot kanamycin, neomycin, paromomycin, ribostamycin och lividomycin, är en del av en större DNA-region som innehåller tandemparet aph(3″)-Ib – aph(6)-Id av resistensgener som ger streptomycinresistens hos Corynebacterium spp28. Identiska aminoglykosidresistansregioner hittades i plasmidet pTP10 från C. striatum i nära anslutning till erytromycin- och kloramfenikolresistansregionerna29. Som förväntat bar de 10 C. striatum som var resistenta mot kanamycin på aph(3′)-Ic-genen. Denna gen upptäcktes dock även i stammar som är mottagliga för kanamycin, vilket troligen beror på mutationer som påverkar den kodande sekvensen eller dess promotor. Dessa resultat bekräftar att aph(3′)-Ic-genen är utbredd i Corynebacterium spp. Resistens mot streptomycin hos Corynebacterium spp. hänger samman med förekomsten av tandemgenerna aph(3″)-Ib och aph(6)-Id, som kodar för aminoglykosid-3″-fosfotransferas respektive aminoglykosid-6-fosfotransferas28. Fem av de åtta isolaten som var resistenta mot streptomycin bar på aph(3″)-Ib- och aph(6)-Id-gener, och de återstående tre hade MIC för streptomycin i intervallet 1-4 mg/L, troligen som en följd av mutationer i de ovannämnda generna eller i deras promotor. Andra mekanismer, t.ex. aktivt utflöde av det antimikrobiella ämnet och minskat intag i bakteriecellen, kan bidra till streptomycinresistens hos dessa isolat. Amikacin förskrivs eventuellt i kombinationsbehandling mot allvarliga infektioner orsakade av C. striatum på FHU-sjukhuset. Våra resultat tyder på att amikacin är den bästa aminoglykosiden för behandling av C. striatum-infektioner medan gentamicin kan vara ett giltigt alternativ. Förekomsten av resistenta stammar kräver dock ständig vaksamhet.
Erythromycin och klindamycin var inaktiva mot majoriteten av våra C. striatum, särskilt klindamycin, med ett MIC90 åtta gånger högre än erytromycin. Detta faktum bekräftar den tidigare rapporterade höga prevalensen av resistens mot föreningar från MLSB-gruppen bland Corynebacterium spp, inklusive C. striatum30. MLS-resistens hos Corynebacterium spp. förmedlas oftast genom två mekanismer: modifiering av målplatsen med hjälp av ribosomala RNA-metylaser som kodas av de s.k. erm-generna och aktivt läkemedelseffektflöde med hjälp av en membraneffluxpump som kodas av genen mef(A-E)31. Våra resultat bekräftar resultaten från tidigare studier som visade att erm(X) är den viktigaste genen som är inblandad i MLS-resistens hos Corynebacterium spp29, 32. För första gången har vi upptäckt erm(B)-genen som kodar för det ribosomala RNA-metylaset Erm(B) i C. striatum. Genen erm(B) ger hög resistens mot makrolider hos Campylobacter coli33 och andra relevanta patogener, men är exceptionell hos Corynebacterium spp31, 34. Tio av våra stammar bar generna erm(B) och erm(X) samtidigt, en egenskap som tidigare rapporterats endast hos en stam av C. urealyticum31.
En tredjedel av våra C. striatum uppvisade resistens på medelhög eller hög nivå mot ciprofloxacin och moxifloxacin. Fluorokinoloner har använts intensivt på FHU-sjukhuset under de senaste två decennierna. Vid antibiotikaadministration skapas ett selektivt tryck i kroppens organ där fluorokinoloner tenderar att ackumuleras. Exponering för fluorokinoloner selekterar för spontana mutanter i stora bakteriepopulationer, inklusive de som koloniserar hud och slemhinnor, t.ex. corynebakterier. Således har fluorokinolonresistens uppstått i kliniska isolat av C. striatum och C. amycolatum35. Resistens mot fluorokinoloner hos Corynebacterium spp. orsakas av mutationer i QRDR i gyrasegenen gyrA. I våra stammar genererade enstaka aminosyrasubstitutioner i position 87 i GyrA-proteinet ciprofloxacinresistens, men dubbla mutationer i gyrA-genen som ledde till förändringar i positionerna 87 och 91 var nödvändiga för att uppnå hög resistens mot ciprofloxacin och moxifloxacin. I fjorton av de 21 fluorokinolonresistenta C. striatum var ökningen av MIC för ciprofloxacin och moxifloxacin till 16 mg/L relaterad till en dubbel icke-konserverande mutation i positionerna 87 och 91. Sierra et al.35 rapporterade också dubbla mutationer på positionerna 87 och 91 i gyrA-genen hos sex av deras C. striatum, även om MIC av moxifloxacin för deras stammar var lägre (6-8 mg/L). Fem av våra stammar med enkelmutationer i positionerna 87 eller 91 är fortfarande resistenta mot ciprofloxacin även om de har lägre MIC (i intervallet 2-8 mg/L) medan MIC för moxifloxacin ligger kvar på 1 mg/L. Enskilda mutationer i Ser-87 eller Asp-91 som beskrivs av Sierra et al.35 ökade MIC för ciprofloxacin till 1-6 mg/L, medan de fortfarande var mottagliga för moxifloxacin. Den högre nivån av moxifloxacinresistens hos våra stammar tyder på att det finns en resistensmekanism utöver mutationer i gyrA. Hos två stammar upptäcktes inga förändringar i deras QRDRs, vilket tyder på att resistensen medierades av en annan mekanism.
β-laktamer är den mest allmänt använda klassen av antimikrobiella medel. Framgångsrika behandlingar av C. striatum-infektioner med penicillin36 eller amoxicillin37 har rapporterats. Låg känslighet för penicillin och cefotaxim bland andra β-laktamer har dock meddelats10, 38, även om den genetiska mekanismen för resistens hittills inte har karakteriserats. Med tanke på MICs90-värdena (16 mg/L) visade penicillin och cefotaxim samma låga aktivitet mot vår C. striatum. Det faktum att andelen penicillinresistenta stammar är högre än andelen cefotaximresistenta stammar förklaras av att CLSI:s brytpunkt för känslighet för penicillin nyligen har sänkts från 1 mg/l till 0,125 mg/l39. Hydrolys av β-laktamantibiotika genom β-laktamas är den vanligaste resistensmekanismen för denna klass av antibakteriella medel hos kliniskt viktiga bakterier. β-laktamaserna klassificeras genom proteinsekvens i fyra molekylära klasser, A, B, C och D, baserat på bevarade och särskiljande aminosyramotiv. Femtiotvå av våra stammar var resistenta mot penicillin och denna resistens var relaterad till förekomsten av en bla-gen som kodar för ett β-laktamas av klass A. Kromosomerna hos Corynebacterium jeikeium K41140, Corynebacterium urealyticum DSM 710941 och Corynebacterium resistens DSM 4510042 kodar för motsvarande motsvarigheter till C. striatum bla-genen, även om den inte har förknippats med resistens mot β-laktamer hos dessa arter. AmpC-genen, som kodar för ett β-laktamas av klass C, upptäcktes i 42 av de 52 penicillinresistenta C. striatum. AmpC-generna, som är vitt spridda bland Enterobacteriaceae, kodar för enzymer som är aktiva mot både penicilliner och cefalosporiner43. Vi visar här att två β-laktamaskodande gener, bla och ampC, förekommer i β-laktamresistenta C. striatum. Våra data avslöjade höga resistensnivåer mot β-laktamer och en hög prevalens av bla- och ampC-generna bland C. striatum som isolerats på vårt sjukhus. Dessa data är av värde för praktiker och avråder från att använda β-laktamföreningar för behandling av infektioner orsakade av C. striatum.
PFGE anses vara den gyllene standarden i epidemiologiska studier av patogena mikroorganismer och ger viktiga insikter i deras populationsstruktur44. Våra resultat visade 22 distinkta PFGE-mönster från 63 stammar av C. striatum. Den stora mångfalden av genotyper bland de 63 C. striatum-stammarna visade att de huvudsakligen inte är nära besläktade. Därför kan C. striatum på FHU-sjukhuset ha sitt ursprung från olika linjer och källor i stället för expansion av en enda klonallinje. Detta motsvarar det patogena tillståndet för C. striatum som en opportunistisk patogen som orsakar tillfällig sjukdom hos predisponerade patienter. Vissa PFGE-mönster isolerades oftare, vilket tyder på att det finns ett fåtal mer utbredda kloner. Vi betraktar mönster E och A som pulsotyper med hög prevalens. De flesta C. striatum som tilldelats pulsotyperna E och A var högresistenta, vilket tyder på att de mest utbredda klonerna är högresistenta, vilket tidigare har rapporterats10, 16. Det faktum att många olika antibiotikaresistensprofiler kunde urskiljas bland de stammar som tillhörde ett visst PFGE-mönster avslöjade att det inte fanns en enda stam utan flera närbesläktade kloner som producerade sporadiska infektioner.
Sammanfattningsvis belyser den här studien relevansen av C. striatum som en framväxande multiresistent nosokomial patogen på FHU-sjukhuset. Isolaten av C. striatum uppvisade 100 % känslighet för vankomycin, linezolid och daptomycin och höga nivåer av resistens mot rifampicin, föreningar från MLSB-gruppen, fluorokinoloner och β-laktamer. Bland de olika kloner av C. striatum som cirkulerar på FHU-sjukhuset var de mest utbredda de mest resistenta. Därför bör övervakningen av MDR C. striatum fortsätta.